实验动物的标记与分组
每每看到五花八门的分组，眼花缭乱的标号，我心底总觉得他们像在过家家似的游戏，只不过这游戏却又有着科研的神圣的光环。有的人在动物拿来后，匆匆地随手扔，扔到哪笼就哪笼。有的人标号很混乱，令人眩晕。有的人根本不知何为随机？但，标号与分组，确实是动物实验中最基本的常识。为何这么多人会不按章法一顿乱搞呢？无外乎是两个原因最为主要：一是缺少这方面的知识；二是一知半解，不够重视。
因此，本期的专题想来谈谈这两个小问题。
一般而言，标号是在分组之前。标号之后再随机分组。下面我们按照以下标题来逐个进行讨论。
一、常用的标号方法及其优缺点
二、常用的染色试剂及大、小鼠标号方法
三、分组的原则及设计简介
四、随机分组的方法
五、每组动物数的确定
第一、常用的标号方法及其优缺点
实验动物在运来之后，要经历什么样的步骤呢？
首先，要确认品系、雌雄、数量，并观察有无不良状态。这相当于一般商品交易中的“验货”环节。
第二，要进行适应性喂养。在此期间只需按雌雄分笼，每笼饲养适当数目即可。这个时间至少三天，多则一周。在前面的专题中已有述及。
第三，对动物进行标号。有多种方法，下面将一一具体介绍。
第四，随机分组。注意，不是随机分组再标号，而是标号后再分组。因为没有标号是没法随机的。
第五，进行实验处理。从这里开始，才是真正进入主题的实验了。包括造模、给药、手术等等处理。
下面我们就先来讲讲编号的方法。
标号是动物实验中非常重要的一项工作。因为一个实验中的动物品系一样、生物学特征基本无差异，不进行标号就没法识别。这样，实验也就无从进行。标号就是为了对实验动物“了如指掌”，便于记录和检测。标号方法应保证不对动物生理或实验反应产生影响，且号码清楚、易认、耐久和适用。标号一般借助于动物本身的一些特征来进行，如：被毛、脚趾、耳朵等；也可以辅助器具来进行，如：金属环或牌；也可以给单笼饲养的动物笼具编号以便识别。
目前常用的标记编号方法有染色法、耳孔法、烙印法、挂牌法等。此外还有断趾法、剪尾法、被毛剪号法、笼子编号法等。
A 染色法
染色法是用化学物质在实验动物身体明显的部位，如被毛、四肢等处进行涂染，以染色部位、颜色不同来标记区分实验动物，是最常用、最易掌握的经济方法。据染液的不同，可染成黄色、红色、咖啡色、黑色等。此法适合于被毛白色的动物，如：大鼠、小鼠。但像C57小鼠为黑色或褐色，则不宜用。
B．耳孔法
耳孔法是用打孔机直接在实验动物的耳朵上打孔编号，根据打在动物耳朵上的部位和孔的多少，来区分实验动物的方法。用打孔机在耳朵打孔后，必须用消毒过的滑石粉抹在打孔局部，以免伤口愈合过程中将耳孔闭合。耳孔法可标记三位数之内的号码。另一种耳孔法是用剪刀在实验动物的耳郭上剪缺口的方法，作为区分实验动物的标记。如：兔。
C．烙印法
烙印法是直接把标记编号烙印在实验动物身体上，尤如盖印章一样。烙印方法有两种，对狗等大动物，可将标记号码烙印在其皮肤上（如耳、面、鼻、四肢等部位），对家兔、豚鼠等动物，可用数字号码钳在其耳朵上刺上号码；烙印完成后，伤口涂抹酒精黑墨等颜料，即可清楚读出号码。烙印法对实验动物会造成轻微损伤，操作时宜轻巧、敏捷，必要时麻醉，以减少痛苦。
D．挂牌法
挂牌法是将编好的号码烙印在金属牌上，挂在实验动物颈部、耳部、肢体或笼具上，用来区别实验动物的一种方法。金属牌应选用不生锈、刺激小的金属材料，制成轻巧、美观的小牌子。
我们可根据实验动物品种、实验类型及实验方式，选择合适的标记编号方法。一般来说，大、小鼠多采用染色法，家兔宜使用耳孔法，狗、猴、猫较适合挂牌法，狗还可用烙印法。
E 其它方法
断趾法：剪去的一部分脚趾可渐渐长合，因此，不是太好分辨。
剪尾法：有损伤。
被毛剪号法：适合标号数字较小的，一般在５以内的数字。
笼子编号法：适合于单笼饲养的动物。
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二、常用的染色剂及大、小鼠染色方法
常用染色剂如下：
（1）3% ~ 5%苦味酸溶液（即２，４，６－三硝基苯酚），因与动物的被毛中的蛋白发生反应，可染成较为牢固的亮黄色。可用水，也可用一定浓度的乙醇来配制。
（2）0.5% 中性红或品红溶液,可染成红色。
（3）2%硝酸银溶液，涂染后在可见光下暴露十分钟左右可染成咖啡色。
（4）煤焦油乙醇溶液，可染成黑色。
染色法适用于被毛白色的实验动物，如：大鼠、小鼠等。
涂染方法：
１单色涂染法
单色涂染法是用单一颜色的染色剂涂染实验动物不同部位的方法。常用的就是苦味酸，或者品红。也有用苦味酸标雄性，品红标雌性的。均可。
根据个人习惯及不同实验室的传统，可有多种不同的编号方法。当前的编号方法可谓林林总总，新的“发明创造”很多。甚至一个实验室不同的人做实验，编号方法完全不一样。但，在此，我想提醒大家一下：同一个实验室，标号方法最好统一。众所周知，药理实验一般都是要靠两个及以上的多人合作才能完成，非常需要协作精神。而如果参与实验的人对其中一个的编号方法不熟悉，就可能导致误拿，或者降低工作效率。因此，统一编号是非常重要的。
在此，我介绍一种本人长期使用的编号方法。这也是《医学科研导论》一书中推荐使用的方法。优点是：可编1~999之间的号码，且标志明显，易学易用，对于统一编号很有参考价值。适合于小鼠、大鼠、豚鼠的编号。
如图，以小鼠为例。以俯视图来看，右侧为个位，耳朵下表示“１”，右前肢表示表示“２”，右腹侧表示“３”，右后肢表示“６”；同样，左侧表示十位，其余与右侧一样；中间表示百位，两耳之间表示“１”，两前肢中间表示“２”，背正中表示“３”，尾椎处表示“６”。其余数字由上述数字进行组合，如：４＝１＋３，５＝２＋３，７＝１＋６，８＝２＋６，９＝３＋６。但“３”不能由“１＋２”来表示，因为本身就有。因此，不可能出现耳朵和前肢同时有标记的现象，也不可能出现在同一侧有三处标记的现象。
如：48，则在左侧耳下及腹部各标一点，在右侧前、后肢各标一点。
我想，大家应不难根据上述规则读出下图最右侧图中标记的小鼠的编号。
此法的优点就是清晰易辩，可编号码数多；缺点就是因涂染点较多，故涂染时要牢固，如不太清晰，隔一定时间要加染。
有人喜欢把每一笼中的动物分别标为１，２，３，４等等。个人觉得这样不可取。一则，这样的标号肯定是没有进行随机分组的。二则，做实验时一不小心就全乱套了。
2双色涂染法
双色涂染法是采用两种颜色同时进行染色标记的方法。例如用苦味酸（黄色）染色标记作为个位数，用品红（红色）染色标记作为十位数。此法略嫌烦杂。一般不太用。
3直接标号法
直接标号法是使用染色剂直接在实验动物被毛、肢体上编写号码的方法。偶用。
染色法虽然简单方便，不会给实验动物造成损伤和痛苦，但是长时间实验会使涂染剂自行褪色，或由于实验动物互相嬉闹、舔毛、摩擦、换毛、粪尿和饮水浸湿被毛等原因，易造成染色标记模糊不清。因而用于慢性实验时，要注意不断地补充和加深染色。一般而言，半个月左右加深一次效果不错。当然，也可以视情况随时补充。
另外，常用染色剂的毒性对实验动物的影响也是需要注意的一个问题。
三、分组的设计
前已述及，经过适应性喂养、编号之后，我们就可以着手来分组了。但是，如何分组，要考虑两方面的问题：一是分几组？这涉及到实验设计的问题；二是如何把动物随机地分到这些组中去？下面我们来讨论第一个问题。如何随机在下一贴中再述。
分几组？每一组的干预处理是如何设计的？这是在还没做实验之前就应该确定好的方案。至少应是大体确定，一般不允许在实验开始时临时更换，更不允许将动物养了一段时间之后再决定如何分组。
做动物实验，很讲究“齐同对比”。
因此，第一个设计原则就是：要设立对照组。
按对象不同，可分为自身对照和平行对照；按目的不同，可分为空白对照（正常对照）、模型对照和阳性对照。
1自身对照组
自身对照是把实验动物本身在动物实验前、后两阶段的各项相关数据，分别作为对照组和实验组的结果并进行统计学处理。也可以是自身不同部位的对照，如：左侧和右侧，前面和后面等。
2平行对照组
平行对照组就是与实验组平行地设置另外的组，使之与实验组能够进行对比。它可分为分正常对照组、模型对照组和阳性对照组。
空白对照就是对动物不施加任何处理，正常饲养；或者必要时给予蒸馏水、生理盐水或其它药物的溶剂等。空白对照的设立就是为了突出正常动物与造成疾病的动物之间有何差别？
模型对照组通常就是以一定的方法造成动物的疾病，而不施加任何的处理。也就是说，想看在疾病状态下，没有任何干预措施的动物表现是如何的？模型对照的设立就是为了与空白相对比。当然，如果实验中不研究动物在疾病状态下的表现，而只需看看药物或化合物对正常动物的作用，则可不设立模型组。
阳性对照组通常是将模型动物给予一定的确实有效的药物加以处理，看看其治疗效果如何？阳性对照药的目的，就是看在此模型状态下，药物是否对之有效？假如阳性对照药都没有效的话，那可能此模型或者给药方式有问题；而阳性对照药有效，被测试的药物没有效，则说明被测药物不行。另一方面，被测药物与阳性药物对照，可看出孰优孰劣。因此，经此对比，可以突出被测药物的作用。但，并不是每一个实验都能找到阳性对照药，也不是每一个实验都需要设置阳性对照组。
例如：要观察某种药物对糖尿病的药效。首先，我们要设立一个空白对照，这样才能看出糖尿病的动物与正常动物的区别。第二，我们要有一个模型组。就是说，造成糖尿病，但不施加任何处理，任其得病，这样，才能与正常动物比较。因此，空白与模型通常是相对立而存在的。我想看某药是否有效，假如给药后的结果与糖尿病模型组没有显著差异，那是否就说明我的药物没有效呢？一般来说是的。但是，给予一个阳性对照药就更能确定。阳性对照药一般是临床上常用的药物。如果临床上用的药物对此动物模型没有效的话，则一方面说明此模型不适合作此类药物的筛选。
第二个方面就是：实验设计。
目前，常用的方法有：完全随机设计、随机区组设计、拉丁方设计等。实验设计方法不同，则随机方法不同。
1 完全随机设计
这是医学科研中最简单的一种设计。就是把动物或标本不加区分地随机分成若干个组。这种设计有一个重要的前提，那就是：所有动物必须是“同质”的，或者近似“同质”的。这种设计最好是各组动物数相等．这样的统计效最高．如实在难以做到，也就比较接近．切忌有人为了节省动物，把正常对照组的数目设计得比其它组少．关于其原理，统计学上有详解．
２ 随机区组设计
也称为配伍组设计．适合于两因素的实验．比如，既要考察几种药物对某一疾病的影响，又要考察年龄因素对疾病的影响，可采用此法．它要求随机先按某一因素分成相等的几组，再在组内按另一因素分成几个区．它对动物的要求比较高．而且在实验期间动物死亡而导致某一数据缺失的话，对统计效能的影响较大．因此，适合一些对动物损害不是特别大的实验．
四、随机的方法
所谓随机，是指机率均等。对于这个，我们并不陌生。日常生活的中抓阄，就是一种随机。福利彩票中的电脑抽奖也是一种随机。
那么，在动物实验中，随机分组就是要把等质的动物以相等的机率分配到预先设定的各组中去。
请注意这个“等质”的前提。这是不能忽视的一个因素。如果一批小鼠中，小的有18g的，大的有32g的，体重相差比较大，我们按随机方法分配到各组，那这样的结果实际上并没有达到我们的目的。因为这样有的组分到体重特别大的，有的组分到特别小的。又如：40只体重差异符合要求的小鼠，雌雄不拘，随机分组，那这样得到的结果能会是“等质”的吗？我想，很难保证每个组雌雄的数目相等吧？因为，性别不同，即使体重差不多，也不是“等质”的。所以，在进行随机之前，我们要做的一个事情就是：先把雌雄分开，然后各自按体重分层。基本保证个体都在平均体重的20%上下波动。雌雄分别随机，然后各层内分别随机。所以，我们可见到在论文中，经常会有这样一句话，“按性别、体重分层随机分为……”。
那么如何实现随机呢？目前的方法主要有：随机数字表、软件法、计算器法。
１随机数字表法 这是一种比较传统的方法。在数理统计或者科研设计的书后，通常附有随机数字表。这个表是由计算机排出来的。我们按照一定地方法查，就能得到我们所需要的结果。首先，要知道实验分为几个组。计算出每组多少只动物。比如，分为４个组，每组12个动物。然后，从这个表的任何一个位置查起，可以向任意一个方向查。事实上，我们多数习惯从左向右查。把查到的第一个数字除以总的动物数(此处即为48)，得到余数。得到余数为1~12为甲组，13~24为乙组，25~36为丙组，37~48为第四组。当随机数小于除数本身，则余数为随机数本身。除尽的话，余数算作除数本身。这样，就可以把各个号随机分配到各组。但通常一次操作不能使各组的数目相等。这就需要调整。如何调呢？就是把数目最多的调往最少的。选择哪一个调过去呢？要接着查随机数字，但除数变为数目最多的那组的数字，余数为几，就调第几个数字到最少的组。如此反复，直至调到相等为止。
从上述做法我们可以看出，其过程比较繁琐，对于大数目的动物要快速实现随机并不是很实用。但是，它让我们了解了随机方法的特点。而且，在没有计算机的情况下，不失为一种重要且几乎唯一的方法。
２软件法 许多统计软件都可以进行这一过程。我们常用的Excel就可以实现这一功能。尽管像著名的统计软件SAS，SPSS都有这一功能，但为了普及简便方法的应用，我还是推荐Excel。因为它是目前我们最常用的必不可少的办公软件。且使用它进行随机时，不需要编程，且其表格功能十分灵活，便于编辑和保存。一般操作方法是：在第一列按顺序把各动物编号按升序排列，然后在第二列以Excel中自带的“RAND（）”函数插入随机数，以拖曳功能将各个编号附上一个随机号。然后把这些随机数通过“复制”－“选择性粘贴”－“数值”操作而固定下来，再与动物编号一起以“扩展区域”形式按升序排列，即得到了各组的随机号码。其具体操作参见：周一平．用Excel软件进行药物毒理实验的随机分组．医药沙龙．2005;29(9):425-427. 当然，熟悉SPSS、SAS的朋友也可用其实现这一功能。SPSS操作的方法参见：黎明，韦强.用统计分析软件随机分组与随机抽样的方法.广西中医学院学报.2003;6(1):108－110. 个人认为，用SPSS操作比Excel稍嫌麻烦，不过，随后的统计分析却方便一些。
软件操作的优点就是：可进行大量数目的随机过程，快速、简便，并对于后续操作十分有利。这样，我们省去了去查阅随机数字表的麻烦，２～３分钟就轻松搞定一个随机分配过程。不过，我仍然建议初学者学会使用随机数字表，就像能精通计算器的人也要先学学珠算一样。这样，一则是能在没有计算机的情况下实现随机；二则是能更加感受到使用计算机的快捷。
３ 计算器法 这一方法只适合于分两组时的情况。计算器有个随机数的功能。能给出１以下的任意一个随机数。可以把大于0.5的分于甲组，小于0.5的分于乙组。不断地按计算器，就可以快速地实现随机。当然，这一般是在没有计算机，且不愿意查随机数字表下选择的方法。但这一方法应用并不多。目前用软件法是一个主流趋势。
一点多余的讨论：虽然目前计算机的广泛使用使得随机分组成为一个非常简单的事情，但我想，在没有计算机出现以前人们做实验时是怎样随机分组的呢？这就是说，在没有计算机、没有随机数字表（此表也是由计算机排出来的）的情况下，我们怎样去实现随机呢？
一是抓阄法。但这种方法并不是完全随机。它受到阄的形状、大小的影响。也就是说，当把阄团分散开来的时候，是否机率是相等的？常见的是拿扑克牌来抽取，或者自制纸团。这种方法带一点游戏性质。用于科研多有不妥。
二是“土办法”。有些年龄较大的做药理的科研人员并没有受过严格的随机的训练，在当时也没有计算机的普及，于是他们在实践中总结出一些实用的方法。其做法也很简单：把同质的动物依次放到几个组中。比如，有四个组，第一轮按照1,2,3,4的顺序来放，第二轮按2,3,4,1的顺序来放，第三轮按3,4,1,2的顺序来放，第四轮按4,1,2,3的顺序来放，第五轮按1,2,3,4的顺序来放，如此反复，直至分配完成。这种方法有一定的随机作用，但只能属于半随机。因为，在放动物的时候，是按照一定的顺序的，但这种顺序又有一定的变化。就是说，抓动物是随机的，但放的时候并不是完全随机，而只是尽量使每组的机会均等。记得小时候农村里分鱼的时候，就是用这种方法。这种方法有一定的实用性，但在计算机普及的今天，在严谨的药理实验中，理应淘汰。
五、每组动物数的确定
对于在实验中每组要多少动物，很多人是很模糊的。有的人每组给6只，有的人给8只，有的人给10只，也有12只以上的。但似乎没有一个统一的规定。
有人说，可以用理论计算样本量。但很多人忽略了计算样本含量的前提条件：要有预试验结果。要知道预实验中每组样本数、均值及标准差。在没有做之前，我们怎么可能知道这些数值呢？在有些实验中，我们可以参考前人做过的类似的实验的结果。但，多数情况下，我们是没有参考的。
下面，我从个人有观点及角度出发，来探讨一下，我们每组给多少个动物合适呢？也就是说，我们能否给出一个大致的下限和上限呢？有人说，下限肯定是要的，上限就不必吧？但我想说，上限同样是要的，动物并不是越多越好。因为动物越多，同一组或同一区组内“同质”的可能性越小。这样能统计带来很大的麻烦。因此，要有一个合适数字。
这是一个看似简单，其实比较容易迷糊的问题。要完全解读这一问题，要进行大量的讨论。在此，我想用以下的几个贴子从比较浅显的角度来讨论一下。
要解决的问题有两个：一是动物数太少会出现什么样的后果？以具体实验来分析；二是样本含量计算公式它是一个万能的吗？它有多大的实际意义？这一点我曾经在其它版块进行过讨论，但一直没有人能给出最有说服力的解释，大多是照搬书上的条条框框。在此我将以个人角度提出一些看法，供大家探讨。
还是从最简单的情形出发，来讨论一下。假设要比较两个组均数有无差异，取样本量多少合适？
要搞清楚这个问题，我们得先了解一下统计学常识。
正如大家所熟知的，在比较两组均数是否有差异的时候，我们有两类检验方法。
在样本呈正态或近正态分布的情况下，我们通常采用t检验。
而样本不呈正态分布的话，我们通常是用非参数检验。比如：秩和检验。说得通俗点，后一种方法就是让每组各个数据来进行排队，看看由这些数据形成的中位数，以及“”排队“的次序是否有大的差别。如果没有，在一定的犯错的概率之下，我们可认为二者没有差别。这类统计方法往往效率较正态分布的数据要低，需要的样本数更多。因此，在此，我们先讨论在正态分布下的情形。
两组数据均数比较t检验的基本思想是：将两组的数据均值相减，得到差值；然后以差值除以两组的合并标准误，得到的数值在某一个范围内的话，可认为二者没有差别。当然，这里涉及到P值的问题。P=0.01和p=0.05时，t值的界限是不一样的。我们就以p=0.05为例吧。
首先来看一看两组数据的标准差。我们要由标准差来计算标准误，进而进行t检验。在计算机没有如此发达的早些时候，我们做统计通常是手工计算，然后再查表，来得出结论的。如能用上有统计功能的计算器，如：卡西欧的，那就是天大的宝贝了。在统计软件发达的今天，在几秒筇钟即可得出结论的今天，我们不妨来返朴归真，对我们最简单的一些统计来进行探讨，或许，你能温故而知新，知深。这，对于我们实验的设计，亦有着极强的指导意义。
