作者：黄茹，金梦寒，钟禹农，王克瀚等，南京医科大学附属苏州医院/苏州市立医院生殖

辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）已成为治疗不孕不育的核心手段，作为一种非自然侵入性的技术，其安全性受到广泛关注。研究表明，ART可能与多种不良妊娠结局和子代健康风险相关，包括早产、低出生体质量、出生缺陷及胎盘功能异常等[1]。这些异常的核心机制之一是表观遗传调控紊乱，其中DNA甲基化模式的改变尤为重要。DNA甲基化作为最经典的表观遗传标记，由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化，在基因沉默、基因组印记中扮演关键角色。生殖与早期胚胎阶段是建立甲基化和去甲基化最为剧烈的时期，任何外源性干扰均可能产生持久的影响[2]。目前临床广泛应用的ART主要包括常规体外受精（in vitro fertilization，IVF）、卵细胞质内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）、冻融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，FET）和卵巢组织冷冻保存（ovarian tissue cryopreservation，OTC）。不同技术对配子及胚胎的干预环节、作用机制及施加的应激各不相同，其对DNA甲基化的影响亦可能呈现技术特异性。现以ART类型为主线，依次从各技术的临床应用现状、对DNA甲基化的具体影响、潜在作用机制以及对子代健康的潜在临床意义进行综述，以期为全面评估不同ART的安全性提供理论依据。

1 IVF与DNA甲基化

IVF广泛应用于不孕症的治疗，其基本流程包括控制性超促排卵（controlled ovarian hyperstimulation，COH）、取卵、IVF、胚胎培养和移植。IVF操作可干扰多个发育阶段DNA甲基化的建立与维持。在分子机制层面，COH诱导的高雌激素环境通过激活雌激素受体α（estrogen receptorα，ERα）信号轴，上调TET2（ten-eleven translocation 2）蛋白表达，促进DNA去甲基化，从而导致卵母细胞中母源印记丢失与表观遗传异常[3]。动物实验表明，小鼠暴露于超生理剂量雌激素后，囊胚中DNMT3B的mRNA表达下降，导致H19印记控制区（imprinting control region）出现低甲基化，破坏了正常的父源等位基因沉默，最终可导致小鼠胚胎死亡[4]。另一方面，体外培养环境作为关键应激源，其氧分压显著高于体内生理水平（≤5%），诱导线粒体产生过量活性氧（reactiveoxygen species，ROS）。ROS通过氧化DNMT的催化结构域抑制其活性，同时消耗S-腺苷甲硫氨酸（Sadenosylmethionine，SAM）甲基供体，这导致小鼠IVF囊胚中部分基因组区域发生甲基化偏移[5]。值得注意的是，IVF绕过了输卵管环境，可能避开了自然受孕中对配子或胚胎的生理筛选机制，使母源卵子中预先存在的表观遗传缺陷更易直接传递给胚胎。研究表明，IVF可能增加贝克威斯-韦德曼综合征（Beckwith-Wiedemann syndrome，BWS）的发生风险[6]，并且机制涉及11p15.5印记基因簇的甲基化异常。11p15.5印记域由印记中心1（imprintingcenter 1，IC1）[H19/胰岛素样生长因子2（insulin-likegrowth factor 2，IGF2）印记控制区]和IC2[KCNQ1反义转录本1（KCNQ1 opposite transcript 1，KCNQ1OT1）印记控制区]双中心协同调控IGF2、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C（cyclin-dependent kinaseinhibitor 1C，CDKN1C）等基因的单等位表达。BWS以IC2低甲基化、IC1高甲基化、父源单亲二体或拷贝数异常为主[7]。这些甲基化异常具有明确的功能后果。在胎盘层面，IVF可扰乱H19/Igf2、小核核糖核蛋白多肽N（small nuclear ribonucleoproteinpolypeptide N，Snrpn）、父本表达基因3（paternallyexpressed gene 3，Peg3）、Kcnq1ot1等印记区甲基化，改变胎盘形态并增加成年患代谢综合征的风险。动物实验显示，IVF还导致Kcnq1ot1、Peg10、Sfmbt2（Sfmbt family member 2）等关键印记基因表达异常，影响胎盘发育与营养转运[8]。在子代个体层面，脐带血中H19/IGF2印记控制区的异常高甲基化可扰乱印记调控，导致IGF2表达异常。IGF2作为关键的胎儿生长因子，其表达异常可能通过影响IGF信号通路，改变胎儿生长发育的编程，从而增加肥胖、2型糖尿病等远期代谢性疾病的易感性[9]。

2 ICSI与DNA甲基化

ICSI通过直接将精子注射入卵细胞质内完成受精，主要应用于男性因素不育，且全球应用比例持续上升，在部分中心甚至超过常规IVF。这一趋势与全球性男性生育力下降的流行病学背景密切相关。2022年Hagai Levine团队的研究指出，过去45年间全球性男性平均精子数量下降62%，浓度下降52%[10]。ICSI对DNA甲基化的影响具有技术特异性，且其影响贯穿配子、胚胎和子代发育的全过程[11]。显微注射的物理操作会直接破坏卵细胞质内的微环境，注射针刺入可能损伤纺锤体、细胞微管等骨架结构[12]。ICSI还绕过了自然选择屏障，严重少弱精子症患者的精子存在显著的表观遗传缺陷，其H19/IGF2或δ样同源蛋白1/基因捕获位点2（delta-like 1 homolog/gene trap locus 2，DLK1/GTL2） 印记控制区的异常甲基化率较高[13]。ICSI将这些父源表观遗传缺陷直接引入并可能持续影响胚胎发育。有学者在ICSI子代中观察到的SNRPN基因座高甲基化具有重要临床意义。SNRPN基因位于15q11.2q13区域，其母源等位基因的正常高甲基化对维持基因组印记至关重要。而ICSI引起的异常高甲基化可能进一步强化母源印记的强度，破坏父母源等位基因表达的剂量平衡。这种失衡与天使综合征（Angelman syndrome）和普拉德-威利综合征（PraderWilli syndrome）的发病机制相关[14]，也部分解释了ICSI子代神经发育障碍风险增加的原因。此外，有学者通过甲基化模式推算胎儿发育年龄发现，ICSI来源新生儿的表观遗传时钟较实际胎龄滞后3~4 d，提示全基因组甲基化的建立与成熟进程受损[15]。这种延迟可能与关键发育基因启动子区域的甲基化时序异常密切相关，进而干扰细胞分化和组织功能成熟[16]。因此，评估这些表观遗传异常对子代远期健康状况（如早衰或肿瘤发生）的潜在影响，需要进行严格的长期随访研究。

3 FET与DNA甲基化

自1983年首例人类FET成功报道以来，该技术已成为辅助生殖领域的重要组成部分。FET通过将胚胎冷冻保存后移植，避免了新鲜周期中COH对子宫内膜容受性的不利影响，显著提高了胚胎着床率和活产率[17]。FET对表观遗传的影响核心在于冷冻-复苏过程的物理化学应激。玻璃化冷冻过程中，冷冻保护剂引起的渗透压冲击可导致细胞骨架蛋白（如F-肌动蛋白）解聚，这破坏了细胞核与细胞质之间基于细胞骨架的物质运输，可能引发启动子异常高甲基化及全基因组低甲基化[18]。同时，即使在玻璃化冷冻条件下仍可能形成微量冰晶，这些冰晶产生的机械应力可直接损伤核膜完整性，造成核质渗漏，进一步导致DNMT1、泛素样含PHD和环指域蛋白1（ubiquitin-like with PHD and ring finger domains1，UHRF1）等甲基化维持因子的流失，加剧表观遗传的不稳定[19]。FET操作对DNA甲基化的影响主要体现在配子和胚胎冻存环节。一方面，精子玻璃化冷冻可能增加DNA碎片指数，并干扰印记基因mRNA的正常表达，扰乱表观遗传稳态[20]。另一方面，玻璃化冷冻的小鼠卵母细胞中Dnmt1和Dnmt3b的mRNA水平显著下降，且蛋白定位异常，导致整体DNA甲基化水平下降，进而影响小鼠早期胚胎的体外发育潜能[21]。在胚胎层面，冷冻-复苏过程诱发的氧化应激可能通过p38丝裂原激活的蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）信号通路激活导致DNMT3A/3B的磷酸化修饰异常，抑制其甲基转移酶活性[22]。尽管部分研究指出这些表观遗传紊乱可能在胚胎冻融后部分恢复，但其是否完全恢复以及对子代远期健康的影响仍不明确[23]。值得注意的是，已有研究证实，卵裂率与囊胚形成率的降低主要归因于玻璃化过程本身，而非冷冻保护剂[24]。此外，体外培养与冷冻操作的协同作用可能干扰H19、Peg3和Snrpn等关键印记控制区的甲基化重建，尤其在囊胚阶段，Dnmt3b的持续低表达可能加剧这一过程[25]。这些表观遗传异常可能通过影响胎盘特异性基因的表达参与大于胎龄儿和子痫前期等不良妊娠结局的发生[26]。

4 OTC与DNA甲基化

OTC是儿童及年轻肿瘤患者生育力保存的唯一方法。该技术通过玻璃化冷冻法保存卵巢皮质或整个卵巢，显著减少了冰晶损伤，更好地维持了卵泡和基质结构的完整性，移植后也能有效恢复女性的生殖内分泌与生育功能。OTC操作中，冻融后的缺血-再灌注损伤是表观遗传紊乱的核心机制[27]。再灌注过程中产生的过量ROS（特别是羟基自由基）可能通过氧化DNMT1催化结构域中的半胱氨酸残基（Cys1226），干扰其亲核攻击能力，抑制DNMT活性[28]，但该机制在OTC模型中尚缺乏直接证据。OTC虽避开了原始生殖细胞和植入前胚胎期的全基因组甲基化重编程，理论上风险更低，但其对DNA甲基化影响的研究结果不一。研究发现，冻融移植后的卵巢组织来源的卵母细胞中，生长因子受体结合蛋白10（growth factor receptor-bound protein 10，GRB10）和多型性腺瘤样基因1（pleiomorphic adenomagene-like 1，PLAGL1）等印记控制区的甲基化错误率最高，因为这些区域的CpG岛富含氧化敏感度更高的序列特征[29]。然而，也有研究显示SNRPN和H19等核心印记基因的甲基化模式在OTC子代中基本正常。这种差异可能与不同基因组区域对氧化应激的敏感性、冷冻方案的具体参数以及物种差异有关。目前OTC活产子代表观遗传安全性数据有限，鉴于OTC主要用于年轻肿瘤患者，其子代健康受到特别关注。未来需要建立前瞻性出生队列，采用高深度甲基化测序对卵泡-胚胎-子代体细胞进行配对分析，以明确OTC引起的甲基化错误是暂时性的还是可持续至成年的表观突变，并评估其长期健康风险。

5结语与展望

ART子代甲基化异常已得到证实，且不同ART的干扰效应具有显著特异性：IVF因COH的高雌激素及氧化应激易致印记基因甲基化丢失；ICSI显微穿刺直接损伤父源基因组并可将精子表观缺陷垂直传递；FET玻璃化冷冻-复温产生ROS抑制DNMT，阻碍甲基化维持；OTC组织缺血-再灌注则通过氧化爆发干扰卵泡甲基化稳态。上述发现因不同研究的促排卵方案、培养条件、冷冻参数、测序深度和时点选择不一而结论存在差异。未来应在统一方案下建立多中心前瞻性出生队列，序贯采集配子、胚胎、胎盘及子代样本，整合多组学与类器官模型，纵向解析甲基化动态，并与临床终点关联，形成技术优化-机制验证-规范制定的闭环，为完善ART行业标准、实现安全生育与健康子代提供循证依据。

参考文献略。

来源：国际生殖健康/计划生育杂志2026年1月第45卷第1期