Sanity 2.0 MTBC-MDR同步检测MTBC和利福平/异烟肼耐药性：一种中等复杂度的自动化NAAT技术
研究背景
据世界卫生组织（WHO）估计，2023年全球新确诊结核病病例总数达820万例，其中耐多药/利福平耐药结核
病（MDR/RR-TB）病例约为17.5万例。然而，全球仅有43%的MDR-TB患者接受了治疗。诊断灵敏度有限、诊断延迟，以及严重的漏诊问题，持续阻碍着MDR-TB治疗成功率的提升。作为全球第三大结核病高负担国家，中国在实现WHO“2030年终结结核病流行”策略目标方面面临着严峻挑战。因此，开展准确的早期检测和快速的耐药筛查对结核病的有效防控至关重要。
传统的分枝杆菌培养和表型药物敏感性试验（DST）仍是诊断结核病及耐药结核病的金标准，但存在周期长、操作繁琐及生物安全要求高等局限。WHO推荐使用可靠的自动化核酸扩增检测（NAAT）作为结核病初始诊断及耐药检测的重要工具。其中，Xpert MTB/RIF可在2 h内同时检测结核分枝杆菌复合群（MTBC）和利福平（RFP）耐药性，具有显著优势。然而，该检测无法检测异烟肼（INH）耐药性，加上其专用设备成本较高，限制了它在中国临床实验室中的广泛应用。鉴于异烟肼单耐药与较高的获得性耐药、治疗失败和复发风险相关，迫切需要改进当前以利福平为核心的诊断策略，并开发适用于基层医疗机构、能够同时检测利福平和异烟肼耐药性的快速检测工具。
一种基于多色熔解曲线分析技术的新型诊断方法Sanity 2.0 MTB/MDR应运而生，可实现利福平和异烟肼耐药性的同步检测。该系统“标本进-结果出”的工作流程显著降低了操作复杂度，尤其适用于县（区）级医疗机构。本研究旨在比较Sanity 2.0与Xpert MTB/RIF及表型DST在检测结核分枝杆菌复合群和利福平/异烟肼耐药性方面的性能表现。
研究方法
收集2023年2月至2024年7月在安徽省胸科医院就诊的308例疑似结核病患者的抗酸染色阳性痰标本，经排除非结核分枝杆菌、培养阴性及污染标本后，共298例患者纳入分析。纳入患者痰标本进行BACTEC MGIT 960液体培养、Xpert MTB/RIF检测和Sanity 2.0 MTB/MDR检测；阳性培养物采用微量肉汤稀释法进行利福平和异烟肼表型DST，临界浓度参照WHO标准（异烟肼：0.12 μg/ml，利福平：0.5 μg/ml）。当Sanity 2.0与表型DST结果不一致时，对相应分离株的rpoB、katG、inhA启动子、fabG1及oxyR-ahpC间隔区进行Sanger测序。数据分析采用SPSS 20.0软件计算敏感度、特异度、95%置信区间及一致性Kappa值。
研究结果
一、检测限与特异性分析
Sanity 2.0 MTB/MDR检测MTB对利福平和异烟肼耐药突变的检出限（LOD）分别为3 CFU/ml和30 CFU/ml。该检测对MTB具有高特异性，所有测试的非结核分枝杆菌（NTM）和其他常见呼吸道病原体均未出现假阳性结果。对于异质性耐药突变的检测敏感度，所有8个通道的检测能力范围为10%~30%的突变比例。
二、Sanity 2.0与Xpert MTB/RIF检测MTB和利福平耐药的比较
在Sanity 2.0系统与Xpert MTB/RIF系统的平行比较分析中，两者在MTB检测结果上完全一致，以培养结果为参照标准，敏感度均为99.3%。这两种检测方法在利福平耐药检测方面也完全一致，阳性符合率和阴性符合率均为100.0%，Kappa值为1.00，表明两种分子方法具有高度一致性（表1）。
三、Sanity 2.0与表型DST检测利福平和异烟肼耐药的比较（表2）
利福平耐药性检测方面，共有294份标本纳入分析。以表型DST结果为参照标准，Sanity 2.0检测利福平耐药的敏感度（95%CI）为96.55%（80.37%～99.82%），特异度（95%CI）为99.25%（97.01%～99.87%），总符合率（95%CI）为98.98%（96.80%～99.74%）。
对于异烟肼耐药性检测，共有293份标本纳入分析，以表型DST结果为参照标准，Sanity 2.0检测的敏感度（95%CI）为78.95%（62.22%～89.86%），特异度（95%CI）为99.22%（96.90%～99.87%），总体符合率（95%CI）为96.59%（93.62%～98.26%）。
四、Sanity 2.0与表型DST检测不一致结果分析
在Sanity 2.0与Xpert结果完全一致、与表型DST的利福平耐药结果不一致的3份标本中，1份Sanity 2.0敏感/表型耐药标本经测序确认在检测区域无突变，2份Sanity 2.0耐药/表型DST敏感标本分别存在rpoB基因531密码子（TCG→TTG）和526密码子（CAC→AGC）突变。
在Sanity 2.0耐药但表型DST敏感的2份异烟肼标本中，1份存在ahpC启动子区域突变（-15C>T），另1份存在katG基因315密码子突变（AGC→ACC）；所有8份Sanity 2.0敏感但DST耐药的异烟肼标本均经测序后确认在检测区域无突变（表3）。
研究结论
Sanity 2.0是一种快速、自动化的高灵敏度分子检测方法，对MTBC及利福平或异烟肼的耐药检测性能与现有方法相当。测序分析揭示了其与表型DST不一致结果的可能原因，提示基因型与表型检测具有互补价值，可为临床决策提供更可靠的依据，适合作为基层医疗机构的补充诊断工具。
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