嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面已显示出疗效。然而，由于协调清淋化疗以及在专业中心进行耗时、费力且昂贵的体外患者CAR-T细胞制造的复杂物流，其应用于更广泛的患者群体仍受到限制。通过结合脂质纳米技术、RNA化学和病毒颗粒靶向的最新进展，在患者血流中改造CAR-T细胞正成为一种新兴选择，可能克服当前的局限性。先进的临床前和早期临床研究也支持该策略，证明了可在体内（in vivo）成功改造CAR-T细胞，并在临床试验中产生了部分抗肿瘤反应。

《Expert Opinion on Biological Therapy》近日发表综述，回顾了使用病毒和非病毒载体的递送策略，总结了其向临床应用的转化，并概述了优化策略。作者进一步讨论了当前在靶向特异性、基因组安全性、药代动力学、宿主免疫应答和监管审查方面的挑战。作者认为，尽管仍处于起步阶段，但体内基因改造技术有望在广泛的癌症患者中应用CAR-T细胞疗法，也有潜力在自身免疫性疾病、慢性感染和再生医学中重新编程患者的免疫系统。

体外(Ex vivo) CAR-T细胞制造成本高昂、耗时且物流复杂，限制了众多癌症患者的可及性。

结合脂质纳米技术、RNA化学和病毒颗粒靶向的体内CAR-T细胞工程技术，为体外制造提供了一种有前景的替代方案。

回顾了用于体内CAR-T细胞生成的病毒和非病毒递送策略，及其临床转化和优化方法。

早期的临床前和临床研究证明了成功的体内T细胞工程改造及初步的治疗反应。

尽管前景广阔，但必须克服靶向特异性、基因组安全性、免疫原性和监管审查等关键挑战，才能得到广泛的临床采用。

过继性回输由嵌合抗原受体（CAR）重定向的自体T细胞，已在治疗血液系统恶性肿瘤中显示出持久的治愈效果，特别是在一部分B细胞白血病和淋巴瘤患者中。此外，CAR-T细胞可以在B细胞驱动的自身免疫性疾病中实现“免疫重置”，导致持久的疾病消退。治疗时，通过单采从患者获取T细胞，在体外进行基因改造以表达CAR，扩增至临床相关数量，并在患者接受清淋性预处理化疗后重新回输。靶向CD19或B细胞成熟抗原（BCMA）的自体CAR-T细胞产品已获FDA和EMA批准，用于治疗B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和其他B细胞恶性肿瘤，且clinicaltrials.gov上登记了超过1000项临床试验。迄今为止约有35,000名患者接受了这些CAR-T细胞产品的治疗，证明CAR-T细胞可以实现持久的反应。治疗相关不良事件的管理已高度标准化。在不久的将来，CAR-T细胞疗法可能会纳入一线治疗和/或高危患者，提供治愈性治疗的机会。CAR-T细胞疗法还将允许重新编程免疫系统以治疗自身免疫性疾病、慢性感染，并通过减少纤维化等方式支持再生医学。

目前的体外CAR-T细胞制造过程需要长达10天，并要求医院与专业制造中心紧密合作。虽然技术上可行，但临床管理与患者个体化体外细胞制造的紧密协调存在双方失败的风险，局限于受过特定治疗方式培训的认证中心，以及高昂的治疗成本，极大地限制了广泛患者群体的可及性。估计只有20%符合条件的患者能够获得商业CAR-T细胞产品。目前无法或有限获得CAR-T细胞产品的合格患者群体还在不断增长。

广泛患者群体的治疗还受到临床方案的制约，该方案要求患者接受DNA烷化剂（如环磷酰胺）和嘌呤类似物（如氟达拉滨）的化疗预处理，这两者都与治疗负担、急性毒性和增加的突变风险相关。CAR-T细胞制造失败率（可能因疾病负担和既往化疗所致）是限制能够接受体外CAR-T细胞产品患者数量的一个重要因素。为提高体外工艺效率，正在进行比较研究，例如使用新鲜与冻存T细胞，并评估转导过程中的物理和化学参数。

当前的努力旨在通过向患者应用携带CAR编码基因的递送载体，绕过体外制造过程及其相关的限制可及性的物流，从而实现体内CAR-T细胞工程化来克服这些障碍。在这种情况下，任何成熟阶段的T细胞都可能被修饰，巨噬细胞、单核细胞和自然杀伤（NK）细胞同样可以。

总的来说，体内CAR工程化通过消除个体化细胞生产、简化物流、降低成本并实现更快速的治疗，已成为传统体外制造的一种有前景的替代方案。因此，这种方法正在肿瘤学、自身免疫性疾病和感染性疾病领域，使用广泛的病毒和非病毒递送平台进行探索。

基本原理

体内CAR-T细胞疗法的目标是利用装载有CAR编码RNA或DNA的“现货型”转导制剂，在患者血流中对免疫细胞进行基因工程改造，从而简化向患者提供CAR免疫细胞的过程。这种体内工程化允许在自然的血液环境中对免疫细胞进行基因操作，并受益于基质细胞和免疫细胞通过提供细胞因子或其他因子提供的帮助。该策略因此避免了清淋预处理化疗，后者显然对体内CAR-T细胞工程化是有害的。

该策略的优势理论上还包括药物产品的药理学特性为“现货型”、可储存、供应链简化且可立即使用，并由明确的物理化学组成构成。药物产品的生产可以标准化、受控和规模化，以治疗众多患者（表1）。此类载体还将提供更好的剂量可扩展性，特异性靶向更广泛的免疫细胞群体并引导更广泛的免疫应答的可能性，并最终降低成本，使疗法惠及众多患者，包括疾病快速进展的患者。

 表1：体内CAR-T细胞工程化技术的优势与局限性

表2：处于早期临床试验的体内CAR-T细胞方法

从临床角度看，体内CAR-T细胞制造免除了具有相关风险的清淋预处理化疗的需要。从免疫学角度看，当新改造的CAR-T细胞启动其抗肿瘤反应时，完整免疫细胞库的存在可能更有效地支持旁观者免疫细胞的激活，并可能增强抗原扩散，降低因抗原逃逸导致肿瘤复发的风险。

理论上，体内免疫细胞工程化还允许通过同时使用不同CAR进行工程化，灵活地解决多靶点问题。这些靶点可以是多模式的，例如癌细胞上的个体化抗原组合、免疫抑制性肿瘤基质、肿瘤驻留的先天免疫细胞或CAR-T细胞功能的再激活。

虽然目前大多数体外CAR-T细胞产品设计用于持久性CAR表达，但基于RNA的工程化产生瞬时CAR表达，可能允许在出现副作用时调整剂量，并逐步增加剂量以提高疗效。理论上，基于RNA载体的体内工程化可能需要多轮应用以产生更持久的CAR-T细胞库，从而允许新鲜T细胞（功能增强）有一个恢复期。与此方向一致，体外制造细胞产品的经验表明，较少的体外扩增CAR-T细胞和/或应用前的亚生理性细胞因子刺激，有利于体内的扩增和功能性。综合考虑这些因素，体内CAR-T细胞工程化似乎将为体内CAR-T细胞扩增提供机会，而无需有害的T细胞预激活，这可能延缓CAR-T细胞耗竭，并最终带来优异的治疗效果。

体内CAR-T细胞工程化整合了脂质囊泡化学、RNA修饰、病毒学和靶向技术，以及最终复杂的CAR启动的免疫细胞激活（图1）。基本上，将编码CAR的核酸转移到靶细胞采用了两种技术：可注射且可扩展的多组分脂质纳米颗粒（LNPs）递送RNA，以及携带能够整合到基因组DNA中的有效载荷的靶向病毒颗粒。虽然RNA转移允许靶细胞瞬时表达CAR，但后者产生稳定的基因修饰，允许CAR在多个细胞扩增周期中表达。

 图1：体内 CAR T细胞工程：汇聚技术和方法。而 mRNA负载的 LNPs只赋予瞬时的 CAR表达，病毒载体介导的 CAR DNA整合能够持久的 CAR表达。LNP优化需要靶向结合剂、RNA/DNA修饰和脂质化学的整合设计。体内 CAR T细胞治疗目前正在进行临床转化

2017年和2018年，两个团队通过递送编码CAR的piggyBac转座子的聚合物纳米颗粒靶向小鼠T细胞上的CD3，以及通过CD8靶向的慢病毒载体在人源化小鼠模型中将CD19特异性CAR递送至人细胞毒性T细胞，提供了首批临床前概念验证。

最初在学术机构开发的用于体内CAR-T细胞工程化的纳米颗粒和靶向病毒包膜，于2018年（Tidal Therapeutics，2021年被赛诺菲收购）和2019年（Umoja Biopharma，Orna Therapeutics，Sana Biotechnology）被生物技术公司采用。随后的几年里，技术兴趣日益增长，目前该领域约有30家公司在开发体内治疗药物。

用于体内CAR-T细胞疗法的病毒载体

使用慢病毒或γ-逆转录病毒载体进行体内基因递送，旨在将编码CAR的DNA整合到宿主基因组中，以实现CAR在T细胞多轮扩增中的长期表达。通常来说，内源性细胞嗜性被消除，病毒包膜被替换为水疱性口炎病毒（VSV）G蛋白（VSV-G）的假型，该蛋白结合低密度脂蛋白受体（LDLR），从而具有广泛的细胞嗜性。为了将其递送至T细胞并最小化对非靶细胞的吸附，包膜需要替代性假型化，例如使用麻疹病毒、尼帕病毒或辛德毕斯病毒的病毒包膜。此外，尼帕病毒糖蛋白具有高滴度生产和被血清抗体中和风险低的优点。

作为概念验证，使用通过高亲和力的CD8靶向设计的锚蛋白重复蛋白（DARPin）部分重定向、同时以尼帕病毒糖蛋白进行假型化的慢病毒颗粒，在体内实现了T细胞的特异性转导。值得注意的是，单次剂量的这种修饰慢病毒足以在体内改造出CD8+ CD19特异性CAR T细胞，能够消除人源化小鼠模型中的B细胞群或B淋巴瘤细胞。类似的CD4重定向慢病毒同样产生了CD4+ CD19 CAR T细胞。靶向CD62L允许修饰初始、干细胞样或中央记忆T细胞；其他T细胞亚群同样可以被靶向。

或者，靶向部分可以融合到去靶向的VSV-G蛋白上，介导特异性受体结合和病毒传播；结合细胞受体ephrin-B2或-B3的模块化NiV糖蛋白融合，或弹状病毒包膜糖蛋白系统也同样被应用。通过将CD47作为“别吃我”信号整合到包膜中，可以减少巨噬细胞对病毒的清除。

病毒颗粒介导的体内CAR-T细胞工程化的首次临床经验

过去几年，生物技术公司开发的多种产品在非人灵长类动物中成功实现了体内CAR-T细胞工程化。首批人体临床试验正在探索通过编码B细胞特异性CAR的病毒载体进行体内CAR-T细胞工程化，这些试验迄今显示出良好的安全性和耐受性，并在治疗B细胞恶性肿瘤方面提供了早期临床疗效或生物学反应的证据，概述如下。

Interius BioTherapeutics（近期被Kite收购）开发了一种SIN（自失活）、复制缺陷型慢病毒载体（INT2104），该载体经过修饰，具有去靶向的VSV-G蛋白与CD7靶向结构域的融合，提供T和NK细胞嗜性，并编码用于治疗B细胞恶性肿瘤的CD20 CAR。在人源化小鼠模型和非人灵长类动物中，静脉注射后实现了特异性CD7+ T和NK细胞转导，导致CD20+ B细胞耗竭，且无重大毒性。针对难治/复发性B细胞恶性肿瘤（INVISE试验）的人体试验已启动，使用单剂量INT2104，无需预先清淋。该试验在首位患者成功治疗后正在进行中，剂量递增和早期安全性/生物活性评估目前正在进行，疗效数据尚待公布（NCT06539338）。

Umoja Biopharma的载体VivoVec是一种靶向CD3的SIN慢病毒载体，另外整合了CD80和CD58共刺激配体以增强T细胞传递。为了使病毒抵抗血清灭活，VivoVec使用Cocal融合糖蛋白进行假型化。在NHP模型中，基于VivoVec的编码CD19 CAR及雷帕霉素激活细胞因子受体的UBVV111载体，在体内实现了高效率的T细胞修饰，伴随B细胞下降作为CD19 CAR T细胞活性的结果。另一种基于VivoVec的产品UBVV400，编码CD22 CAR和雷帕霉素诱导型细胞因子受体，目前正在针对B细胞恶性肿瘤和自身免疫性疾病进行临床评估（NCT06743503）。

Kelonia Therapeutics开发了一种“体内基因定位系统”（iGPS），基于慢病毒载体，其具有修饰的VSV-G包膜蛋白，失去了与天然进入受体LDL-R的结合，并融合了抗CD3 scFv以实现T细胞靶向。在非人灵长类动物中，低至每公斤体重10^8颗粒的体内应用剂量足以改造出介导持久B细胞耗竭的抗CD20 CAR T细胞。同样，产生了具有高频率记忆和干细胞样记忆表型的BCMA CAR T细胞。在巨噬细胞中发现了脱靶CAR表达。一项首次人体临床试验（NCT07075185）已注册，评估基于Kelonia Therapeutics的iGPS™慢病毒平台的体内BCMA CAR T疗法（KLN-1010）。

郑州大学第一附属医院与深圳Genocury有限公司合作，报道了首例使用水痘-带状疱疹病毒（VZV）-G蛋白假型化、由CD38结合物重定向并编码CD19 CAR的逆转录病毒载体，治疗复发/难治性弥漫大B细胞淋巴瘤患者。该患者体内CAR T细胞成功扩增，在输注后第17天达到峰值。临床上，患者在第35天达到部分缓解，毒性可控，包括1级细胞因子释放综合征和骨髓毒性，无神经毒性或感染性并发症。

EsoBiotec/深圳普瑞金生物技术有限公司开发了一种载体，通过TCR结合物重定向至T细胞，并编码在T细胞特异性启动子控制下表达的BCMA CAR。首批接受治疗的多发性骨髓瘤患者出现了客观反应，其中一名患者早在第28天就清除了骨髓中的播散性疾病。这些初步观察突出显示了首次证据，即通过体内CAR-T细胞工程化甚至可以完全缓解。

尽管尚无太多数据，但这些首批临床试验中预期的不良事件相较于体外制造的CAR-T细胞治疗似乎不那么明显。细胞因子释放综合征在颗粒给药后数小时内出现第一个峰值，可能是由于病毒颗粒本身激活T细胞，而在给药后7-14天记录到第二个峰值，可能是由于新成熟的效应T细胞。与体外制造的CAR-T细胞一样，CAR-T细胞扩增的速度和幅度似乎与临床反应相对应。尚未报告严重不良事件或剂量限制性毒性，可能由于给予的病毒起始剂量较低。

用于体内CAR-T细胞疗法的非病毒递送

非病毒递送技术主要使用脂质纳米颗粒（LNPs）或聚合物制剂，它们携带复合的线性或环状RNA。LNP由可电离的阳离子脂质与聚乙二醇（PEG）、磷脂和胆固醇结合而成，并在血清中吸附表面的蛋白质，如载脂蛋白E（ApoE）。LNP可以通过包括抗体在内的蛋白质进行修饰，以改善细胞靶向和随后的内吞作用，从而释放内容物。

或者，由聚（β-氨基酯）组成的聚合物制剂可以通过静电相互作用吸附核酸，并通过pH依赖性内体降解释放内容物。可电离脂质具有高生物降解性和低反应原性的优点。如果聚合物系统比LNP实现更好的内体逃逸，它可以提高转染效率并减少所需材料量。缺点是更强的阳离子相互作用也可能增加毒性，因此疗效提升可能伴随安全性的权衡。然而，由于初始自发递送至T细胞的效率不高，可以通过吸附聚谷氨酸偶联抗体，或通过SATA-马来酰亚胺化学偶联特异性抗体、抗体片段或其他靶向部分来增强T细胞靶向。然而，后者使制造过程复杂化，并限制了可扩展性和长期储存。使用CD3和CD8靶向聚合物装载CD19 CAR mRNA提供了概念验证。

用于基因转移的mRNA装载LNP的概念基于已建立的SARS-CoV2疫苗制造技术，具有成熟的安全性。装载RNA的LNP可以在大流行期间证明的百万剂规模上生产。RNA具有一些优势，因为它可以在体外无细胞转录，大规模生产且生产变异性最小化，且成本效益高。包含5‘和3’非翻译区（UTR）作为RNA帽和表达调节剂。通过掺入修饰核苷如N1-甲基假尿苷，可以最小化模式识别受体（PRR）激活。密码子优化有助于优化CAR表达。

然而，基于RNA的CAR表达是瞬时的，因为没有发生基因整合。为了实现永久性CAR表达，LNP也可以递送编码质粒DNA作为转座子元件，优选侧翼为piggyBac反向末端重复序列，并共递送用于DNA整合的转座酶。然而该方法在一些患者中导致了T细胞淋巴瘤，可能需要其他转座子元件如Sleeping Beauty进行整合。

LNP-based RNA体内CAR-T细胞修饰的临床发展

Capstan Therapeutics（近期被艾伯维收购）开发了通过抗体重定向至特定靶细胞的LNP，这些基于Cell Seeker技术的LNP是高度可生物降解的、可电离的脂质，适合重复应用。靶向CD5的LNP携带成纤维细胞活化蛋白（FAP）特异性CAR的mRNA，在心脏纤维化模型中消除了FAP+成纤维细胞，减少了纤维化并改善了器官功能。携带CD19 CAR mRNA的CD8靶向LNP正在临床开发中；临床前数据显示在人源化小鼠模型中快速的体内T细胞工程化和诱导的抗B细胞活性。间隔3天给予两次CD20 CAR脂质纳米颗粒，耗竭了非人灵长类动物淋巴器官中的B细胞区室。随后主要是初始B细胞的重建，表明体液免疫区室发生了重置。一项用于治疗B细胞自身免疫性疾病的首次人体临床试验已启动（NCT06917742）。此外，深圳MagicRNA正在测试HN2301，一种携带CD19 CAR的CD8-LNP，用于难治性系统性红斑狼疮患者（NCT06801119），此前在非人灵长类动物中使用替代性CD20 CAR获得了有希望的疗效。首批临床数据显示，五名患者成功耗竭B细胞并降低了系统性狼疮疾病活动度。Immorna开发了一种靶向LNP，递送CD19 CAR RNA用于治疗非霍奇金淋巴瘤，目前正在一项临床试验中探索（NCT06618313）。

除了用于特定应用的瞬时CAR表达外，人们对在T细胞中永久表达CAR、在扩增后仍保留CAR表达有浓厚兴趣。永久性CAR表达需要将编码序列插入到安全位点的基因组中。沿着这一思路，Tessera Therapeutics正在使用其专有的LNP递送平台和“Gene Writing”技术，通过单次静脉输注在体内生成功能性的CD19和CD20靶向CAR T细胞，在异种移植模型中产生了完全的肿瘤清除。基因修饰效率在CD20 CAR T细胞中约为30%，足以消除人源化小鼠中的循环人B细胞。NanoCell也通过LNP递送编码CAR的DNA，然而，该DNA通过递送载体中mRNA编码的转座酶整合到宿主基因组中。应注意的是，这些技术仍处于临床前开发阶段。

超越CAR-T细胞：其他免疫细胞群体的体内工程化

尽管T细胞目前是体内CAR工程化的主要焦点，但同样的递送技术可以适应于对其他免疫细胞群体进行基因重编程。将体内CAR工程化扩展到T细胞之外，可以通过利用先天性和适应性免疫细胞的独特生物学特性，实现互补的作用机制。由于LNP的天然趋向性，髓系细胞是mRNA-LNP应用后主要被修饰的细胞。Myeloid Therapeutics利用这一点，并证明LNP介导髓系细胞对CAR mRNA的摄取和表达，导致肿瘤消除。为了稳定在髓系谱系细胞中的表达，使用了与髓系内源性FcR链形成复合物的带有截短CD89（FcαRI）胞内域的CAR。作为概念验证，LNP介导的体内TROP2靶向CAR工程化在小鼠模型中抑制了肿瘤进展。此外，在一项临床试验（NCT05969041）中获得了首批成功结果。在这项针对实体瘤的体内CAR疗法的首次临床研究中，MT-302在27名经过多线治疗的患者中显示出可管理的重复给药和稳健的生物活性，有短暂的CRS，在最高剂量下发生一次4级ICANS事件，以及一名乳腺癌患者确认的16个月部分缓解。转化分析显示CAR+髓系细胞肿瘤浸润、剂量依赖性的IFNγ/CXCL9/10诱导、增强的抗原呈递和增加的T细胞浸润，支持了肿瘤微环境重塑的作用机制证据，以及联合检查点阻断策略的合理性。在另一项开发中，应用携带GPC3 CAR mRNA的LNP在体外人单核细胞和体内食蟹猴中实现了CAR表达。GPC3 CAR LNP目前正在一项针对GPC3+肝细胞癌的临床试验中进行探索（NCT06478693）；首批患者显示出有希望的结果。Her2特异性CAR也在临床前评估用于体内工程化。

CAR巨噬细胞和单核细胞在控制肿瘤进展方面具有吸引力，然而作为终末分化细胞，其缺点在于单采产品中巨噬细胞数量有限且缺乏扩增能力。CD14+单核细胞可以分化为功能性巨噬细胞，使这些细胞成为通过体内工程化获得CAR巨噬细胞的诱人靶点。

在此背景下，Carisma Therapeutics证明巨噬细胞可以在体内被工程化并重定向以攻击肿瘤。与CAR-T细胞相比，CAR巨噬细胞具有显著重塑肿瘤基质、增强抗原扩散并使肿瘤对检查点抑制敏感的潜力。靶向Her2的CAR巨噬细胞诱导了肿瘤缩小（尽管是暂时的）、重塑了肿瘤基质并诱导了适应性免疫。

体内工程化技术带来了新的挑战，包括靶向特异性、插入效率以及遗传和免疫毒性。由于该方法结合了几种尚未在人类中充分探索的技术，每种技术都有其自身的风险特征，因此彻底的监测对于成功转化为常规临床应用至关重要。

体内脱靶递送会稀释载体，降低工程化目标细胞群体的效率。非预期的其他细胞工程化，在最好的情况下，只要这些细胞不能产生或响应CAR信号就不会产生影响；在最坏的情况下，抑制性免疫细胞的工程化会产生免疫抑制并增加疾病进展的风险。尽管如此，对造血干细胞和祖细胞、免疫调节细胞群如调节性T细胞、生殖系暴露以及非免疫细胞中的异位CAR表达的意外转导，是需要关注的安全考虑。此类事件可能损害治疗效果或导致长期不良效应，尤其是在使用整合型载体时。然而载体工程化的最新进展表明，通过日益精准的递送策略，这些风险可以得到实质性缓解。结合CRISPR-Cas9介导的位点特异性整合的T细胞特异性包膜递送载体，最近已通过将CAR插入预定义的基因组位点而非依赖随机整合，实现了体内选择性生成CAR-T细胞。此外，靶向慢病毒载体的早期临床经验表明，给药后几天内载体从循环中快速清除，在尿液、唾液或粪便中未检测到载体脱落，且未观察到对CD3-淋巴细胞、单核细胞或中性粒细胞具有临床意义的脱靶转导。此外，整合位点分析未显示在肿瘤相关基因附近有优先整合，支持了良好的初步生物安全性，尽管长期随访仍然至关重要。总之，这些发现表明，细胞特异性靶向、载体嗜性和精确基因组工程的持续改进很可能大幅提高体内CAR-T疗法的安全性，同时全面的生物分布研究和长期监测仍然不可或缺。

从临床角度看，医生在使用体外制造的商业CAR-T细胞产品方面拥有丰富的经验，并且已经制定了管理CAR-T细胞激活相关不良事件的指南。给药后，CAR-T细胞扩增与治疗效果相关；然而T细胞扩增常伴随严重的炎症事件，如细胞因子释放综合征（CRS）、免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）和免疫效应细胞相关噬血细胞性淋巴组织细胞增生症样综合征（IECHS），所有这些都需要密集的临床管理。这些事件通常发生在CAR-T细胞给药后的一定时间范围内。对于接受体内CAR-T细胞工程化治疗的患者，预计也会出现类似的不良事件模式，可能时间线略有不同。

目前关于体内T细胞修饰的临床经验很少。初步估计，人源化小鼠模型证明了技术可行性，而非人灵长类动物模型（在一定范围内更接近人类情况）未显示出意外的严重不良事件。虽然目前数据不足以得出明确结论，但临床试验中观察到了与体外CAR-T细胞产品类似的CRS和ICANS。可能不同的CAR-T细胞数量和动力学，以及清淋与非清淋免疫环境，也会影响不良事件的类型和严重程度。从体外制造的CAR-T细胞产品治疗中吸取的经验教训明确要求对患者进行长期监测。

体内CAR-T细胞工程化也存在特定挑战。插入型病毒基本上存在致癌风险，尽管罕见，但在传统CAR-T细胞产品治疗后报告了一些CAR-T细胞恶性肿瘤病例；明确的相关性具有挑战性，因为致癌事件数量低，且癌症患者与健康人群相比，其预处理和固有的癌症易感性不同。对于体外制造，转导病毒通常被滴定以达到每个细胞少于5个病毒拷贝整合；然而对于体内感染，需要确定合适的病毒稀释度，以实现每个细胞“安全”的病毒拷贝数和足够高的转导效率。整合位点的影响、与其他癌基因和潜在协同因子的相互作用，以及对血细胞稳态控制的影响尚未完全明了。为了改善对长效体内CAR-T细胞产品的控制，下一代基因组整合型体内颗粒可能会整合CAR表达的开关控制、细胞谱系选择性表达和自杀开关。最终，对接受人类基因修饰细胞产品治疗的患者进行长期监测是强制性的；针对常规CAR治疗的监管指南存在，但需要扩展到体内工程化的细胞产品。

基于RNA的纳米颗粒治疗可能产生一些特定的副作用。例如，纳米颗粒的脂质和聚合物制剂可以诱导急性期反应，而RNA payload可以诱导先天免疫激活。为了允许CAR-T细胞发挥性能并实现数周的深刻临床疗效，可能需要重复的LNP RNA给药，然而这需要进一步的脂质修饰以减少肝毒性和免疫细胞对颗粒的识别，从而降低免疫介导的超敏反应事件风险。在疫苗背景下，据报道重复LNP给药会诱导免疫刺激以及补体激活相关的假性过敏（CARPA），可以通过类固醇、抗组胺药和退热药预处理进行临床管理。通过共工程化携带特异性降低IL6其他炎症细胞因子表达的shRNA的LNP，或添加生物反应调节剂，可以减少炎症反应。模拟病毒的膜基平台，如用于RNA递送的包膜递送载体，可能允许以降低的毒性进行重复给药。

除了毒性问题，持久性仍是体内CAR工程化的主要未解决挑战之一。虽然整合型病毒载体有可能产生长寿的CAR表达细胞，但根据正在进行的临床试验结果，其持久性是否能最终匹配常规制造的CAR-T产品，仍有待确定。相比之下，基于RNA的递送导致瞬时CAR表达，这可能特别适用于需要暂时免疫调节的适应症，如自身免疫性疾病。在这种情况下，瞬时的CD19靶向CAR-T活性可能足以诱导治疗性B细胞耗竭，同时避免长期的免疫抑制。此外，治疗诱导的B细胞耗竭可能有助于重复给予编码CD19 CAR的RNA载体，这可以减少中和性抗载体抗体的产生，从而缓解重复给药的主要限制之一。相反，持续的免疫监视通常是持续肿瘤控制所必需的，使得CAR长期持久性成为肿瘤学疗效的关键决定因素。令人鼓舞的是，整合型慢病毒平台ESO-T01的早期临床经验表明，单次输注后无需清淋化疗即可实现稳健的体内CAR-T扩增。此外，在所有治疗患者中观察到短暂的B细胞再生障碍，随后尽管有持续的临床反应，但出现了生理性B细胞重建，表明即使正常免疫力恢复，有意义的抗肿瘤活性仍可持续。总的来说，这些观察结果表明，体内CAR疗法的最佳持久性要求可能是疾病依赖性的；整合型DNA平台，特别是慢病毒载体，可能最适合需要持久CAR表达的癌症适应症，而瞬时的基于RNA的方法可能通过平衡疗效与安全性并允许重复给药，为自身免疫性疾病提供独特优势。

目前尚未证明瞬时表达CAR的体内T细胞疗法在肿瘤学和/或自身免疫性疾病中是否与体外制造的CAR-T细胞一样有效。然而，体内CAR-T细胞技术可能实现在体内的免疫系统“重置”，从而允许治疗超越当前靶点的疾病。

在治疗B细胞驱动的自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、天疱疮、多发性硬化症、硬皮病）中，使用体外生成的CD19 CAR-T细胞产品，瞬时的但深度的B细胞谱系耗竭似乎是产生持久反应并允许初始B细胞重建所必需且足够的。在这些患者中，不良事件的动力学和频率似乎不如癌症患者严重。高级别ICE-HS和局部免疫效应细胞相关毒性综合征（LICATS；短暂的，主要发生在自身免疫影响的器官）可能在给药后数周甚至数月发生。

使用装载环状RNA编码CD19 CAR的LNP（NCT0601119）治疗SLE的首个人体试验，实现了完全的（尽管是瞬时的）B细胞群耗竭，并在3个月时降低了疾病评分SLEDAI-2K和抗dsDNA抗体滴度（2/5名患者）。安全谱良好，有轻度CRS，无ICANS、显著肝或肾毒性。首批5名患者证明了体内CAR-T细胞治疗B细胞介导的自身免疫性疾病的安全性和有效性，其中瞬时B细胞耗竭似乎足以实现免疫系统的“重置”，且不需要CAR-T细胞持久存在。

在首个体外制造的CAR-T细胞产品获批仅8年后，体内免疫细胞重编程已初现端倪。基于修饰的病毒或非病毒颗粒携带核酸的递送平台，使我们能够在原位改造T细胞以表达CAR。这些技术正在开发中，希望能在可制造性、可储存性、耐受性、可扩展性和治疗效果剂量方面获益，从而克服当前实践中的一些限制。

在肿瘤学中，体内细胞工程化的临床潜力将通过将应用扩展到先天免疫细胞来拓宽，以增强重塑肿瘤基质并使癌细胞易于被摧毁。这一发展也受到重新编程免疫系统以治疗自身免疫性疾病的目标的推动。

即将到来的产品开发

随着体内CAR-T细胞疗法的发展，当前临床产品开发路线图的目标是使用已验证的靶点如CD19、CD20或BCMA，扩大CAR-T细胞的临床应用，并优化技术平台。截至目前，很难预测成功产品进入市场的时间，因为产品设计、靶向疾病和临床剂量的改进需要迭代优化。降低载体免疫原性、提高传递效率和改善靶标选择性是目前优先考虑的事项。

对于基于RNA的CAR表达，通过使用修饰核苷、环状和自我扩增RNA来优化RNA物理化学性质，可以延长CAR表达或降低所需剂量（如疫苗接种所示），同时保持非整合载体的优势。

腺相关病毒（AAV）因其在感染细胞中的附加体持久性而受到体内CAR-T细胞工程化的关注。另一方面，将AAV感染与通过核酸内切酶的基因组整合机制相结合，将允许稳定的CAR表达。此外，AAV衣壳可以被修饰以特异性靶向T细胞，这结合起来可能为靶向和稳定的体内T细胞修饰铺平道路。

对于整合型载体和实现持久CAR表达，正在探索使用CRISPR平台的替代方案进行安全的基因组整合，例如使用逆转录转座子和基于重组酶的基因组整合。基于非病毒基础的替代性精准敲入策略可能是将基因序列整合到预定义位点并允许可控基因表达的优雅方式。首个概念验证证明了在携带所有RNA payload的重定向LNP的小鼠模型中进行了CAR-T细胞修饰。

对于癌症治疗，靶向不同抗原的各种免疫细胞，最好能诱导针对肿瘤基质细胞和癌细胞的协同、全面的免疫反应。当前旨在使用抗体衍生物、纳米抗体或人工结合物靶向递送至各种预定义的免疫细胞亚群的努力，可能有助于在协同作用中诱导针对更大范围靶细胞的更广泛免疫反应。沿着这一思路，通过可移植的生物材料在体内对细胞进行基因工程改造，实现在原位直接重编程免疫应答似乎在技术上是可行的。植入肿瘤环境或引流淋巴结附近，此类装置将促进新改造的免疫细胞被启动并浸润靶器官以产生抗肿瘤反应。

进一步发展的路线图

目前，开发的目标是确保体内细胞和基因组靶向的特异性和效率。对于下一代体内细胞产品，需要定义最合适的靶细胞（亚）群；不同的恶性肿瘤可能需要不同的亚群，并可能需要具有不同靶向部分的颗粒。向靶向先天免疫细胞如NK细胞和巨噬细胞的发展将扩展产品谱并拓宽诱导的免疫反应。然而，这些细胞不像T细胞那样扩增；工程化效率、延长工程化细胞持久性和/或重复给药的适用性需要优化。

除技术可行性外，未解决的问题将决定进一步发展的路线图：

观点

我们正处于第一波探索浪潮中，这将逐步推动递送载体的精炼、基因编辑的精确性、CAR表达的可控性以及临床管理，使体内工程化成为现实，以预定方式重定向免疫反应。这些信息将指导安全监测和管理、剂量，并最终指导可以以成功可能性治疗的疾病。

如果当前挑战能够得到成功解决，体内CAR靶向细胞工程化将把目前复杂、耗时且昂贵的体外制造过程，转变为一种“现货型”、快速且可扩展的治疗模式，以社会经济可接受的成本治疗数百万患者。

参考文献

Markus Barden , Dennis C. Harrer & Hinrich Abken (21 Aug 2026): In vivo CAR T cells on the highway: a roadmap for the next decade, Expert Opinion on Biological Therapy, DOI: 10.1080/14712598.2026.2722287