做一个动物实验,要涉及要许多方面。从实验设计到实验操作,再到实验数据的整理及统计,以及论文的撰写,需要各个方面综合的、零零散散的知识和经验。而泛泛而谈,虽能总括一般的规律,但也许战友们得不到最贴心、最具实用价值的信息。为此,本版将陆续推出一些最基础的专题,从一般到特殊,从抽象到具体,从已知到未知,逐步地深入讨论。希望大家踊跃参与。
下面,我们来讨论在动物实验中的试剂的配制的问题。
分以下几个方面来讨论:
一、 用于实验的试剂的类型及用途
二、 用于实验的试剂原料的贮存方式
三、 用于实验的试剂的溶解度及常用配制方法
四、 配制试剂的常用溶剂及适用范围
五、 配制和使用试剂时的量器、衡器的选择
六、 配制好的试剂的使用和保存方式
七、 配制好的试剂的常见问题及解决方式
八、有毒、危险性试剂的配制及保存
九、试剂配制的优化
十、如何追溯实验中试剂导致的问题?
十一、常用缓冲液的配制
十二、生物类试剂的配制杂谈
十三、如何找到自己需要的试剂?
十四、Do it yourself?还是买现成的试剂?
十五、实验中购买试剂的成本-效用分析
十六、不稳定试剂的配制
此系列贴主要是从大的方向、原则方面来讲述的。对于某一试剂的具体细节问题没有作过深的探讨。各位参与讨论的战友,请着重讲述某具体试剂你是如何配制的?要注意些什么细节问题。希望本贴能长期不断地深入下去。
系列贴子中如有不当之处,请各位不吝指出!
from dxy
首先,我们来了解一下动物实验中需要用到的试剂的类型
按照其贮存状态来分: 试剂有已配好的即用型试剂和需要配制的试剂。
前者,如:一些性质较稳定的、或单剂量包装的试剂。像Western中的DAB显色试剂就有现成的可直接用。后者,如:大多数的药物、试剂。当然,要配制的占大部分。
按其用途来分,可分为:
药物:通常就是我们要考察其药效或机制的化合物或中草药提取物。又可分为原料药和制剂。原料药一般可直接应用。制剂有的要进行提取,有的可直接用。
动物模型用试剂:如:造糖尿病的STZ、造肝损伤的氨基半乳糖胺、四氯化碳、造睾丸损伤的镉剂、造成肺损伤的博来霉素、造成肾损伤的腺嘌呤、造成炎症的角叉菜胶等等。
动物模型用饲料:这个一般是固体状态。也有半固体的。液体状态的较少。如:高脂饲料中要配以胆固醇、丙基硫氧嘧啶、胆酸盐、鸡蛋黄、猪油等。
动物基本操作用试剂:如:麻醉用试剂、动物除毛的试剂硫化钠、动物标记的试剂苦味酸、取血或插管用的试剂肝素、消毒用的75%乙醇、碘伏、新洁尔灭、动物手术后护理的抗生素等。
各类缓冲液或基础分散介质:如:PBS、生理盐水、柠檬酸缓冲液、克氏液、任氏液、配难溶性药物用的0。5%CMC-Na液、DMSO液、增溶剂泊洛沙姆(与药物混匀后再加入溶剂中)
保存标本的试剂:如:10%福尔马林、中性福尔马林、4%多聚甲醛、Bouin's液等。
清洗液:如:稀盐酸液、重铬酸钾洗液。
检测试剂:这个因实验而异。不同的实验有不同的方法。可以另开专题讨论。
按其使用时限来分:
即配即用型:如:STZ极易分解,配制后要迅速全部用完,不然完全失效。一些酶类的试剂,配制后也要尽快用完。已配好的显色剂,通常也是较短时间内用完。对水不稳定的药物,如:青霉素。尽快用完。
可在一周内使用短效型:主要是一些亚稳定状态的溶液。可随温度、氧气的作用而逐渐分解而达不到使用的要求。如:蛋白电泳中的过硫酸铵,是一种促进氧自由基产生的辅助试剂,促进凝胶的形成,时间久了就不能产生自由基,故而一般在一周内使用,最多两周。有些缓冲液,尤其是做离体实验的,一般低温保存下尽快地用完。不然可影响实验结果。
一个月以内的中效型:许多试剂在配好后,如果能低温保存,能用一个月以上。
三个月以上的长效型:不少性质稳定,且对浓度准确度要求不是太高的溶液,可长期保存使用。像福尔马林、生理盐水、CMC-Na溶液。
按其纯度可分为:
化学纯:一般化学实验用的,含少量杂质.纯度一般应在98%以上.
分析纯:做分析实验用的,含微量杂质,纯度一般应在99%以上.缩写: A.R
色谱纯:液相流动相的要求.据本人理解应是不出现杂峰.纯度可能在99.9%.
生化纯:好像在一些生化试剂里有这么写的.缩写:B.R
要注意的是,有些厂家有标明 优级纯(G.R)的, 实际上,可认为相当于分析纯的级别.
还有就是级别最高的:标准品、对照品。其实这二者差别不大。我们通常混用这两个词。按药典规定,我们通常用的基准物质称为对照品。而抗生素类(注意,不是合成抗菌药)的基准物质则称为标准品。而事实上,我们似乎总是把“标准品”当作最高级别,而把‘对照品’当作一个比“标准品”低一点的级别。事实并非如此,这两个词应是一样的。只是标准品特指抗生素或其它生物制品。
特此将二者区分如下:
对照品、标准品系指用于鉴别、检查、含量测定的基准物质。
其中, 标准品特指用于生物检定、抗生素或生化试剂中含量或效价检定的基准物质,按效价单位计,与国际标准品标定。
如:青霉素的基准物质称为标准品,而氧氟沙星的基准物质则称为对照品。但在所发表的论文中,我们所看到的绝大部分情况是二者混用。称青霉素为对照品的、标准品的,都有。
那么这些基准物质要达到什么样的要求?我想,纯度至少要达到99.99%吧。生物制品或抗生素则不一定了,因为有的抗生素实际上就是混合物的。只能用效价来评定。
在配制标准品或对照品时,尤其注意要准确。通常,我们在称量10mg以下的物质时,是很难准的。因此,我们在配某些试剂时,可考虑先称10mg以上的物质配成较大的浓度,再逐步稀释,所得浓度要准确一些。
每一种试剂对不同级别的规定和要求是不同的.
我们可以看到论文中要标明试剂的纯度。通常有写到化学纯、分析纯、色谱纯、纯度达到多少?含标示物多少?等等。这需要在做实验之前了解我们所要用的试剂的纯度要求是怎样的。不然难以得到满意的结果。如:需要用色谱纯的试剂用了分析纯,可能会得到失败的实验结果。
动物实验中,用到分析纯及以上级别的比较多。做药动学实验,液相检测时要注意,要用色谱纯试剂,不然严重影响实验结果。
按其毒性,有无毒、低毒、中等毒性、剧毒几种。
要注意毒性试剂的保存,以及实验过程中自身的防护。
第二,我们来谈谈试剂原料的贮存方式。
这里所指的贮存方式,就是指试剂在提供商送货后,在没有使用之前的贮存方式。以往很多人对这个问题不是太重视。但这是一个重要的问题。不然,实验还没开始,试剂出问题了,得临时更换,误事。或者实验进行中,突然发现试剂已不可用,则可能导致整个实验的失败。因此,做好这个前期工作是十分必要的。
按其状态,有固体、液体、半固体之分。固体相对比较好保存。液体及半固体有的要特别注意。
试剂中一大部分是固体。固体有的是结晶状的,结晶有多种形态,像针晶、柱晶、小鳞片状晶等等。有的是颗粒状的;有的是块状的。其中,针晶、柱晶等流动性比较好,而磷片状的、块状的则不太好。这对以后配制试剂时的称量有一定的影响。这类物质的保存就是要密封好。严格按要求保存。
固体里有一类是比较容易吸湿的。像氯化钙、氯化锌。尤其要注意相对湿度的影响。
按其保存的要求,有常温保存、低温冷藏、普通冷冻、低温冷冻、深低温冷冻(-70度以下)几种。
常温保存的试剂原料,放在实验室存放试剂的柜子中即可。一般要注意避光,并保持温度不致于过高。一般而言,高于35度的话,应注意。再者,要注意,级别不同的试剂要分开来。。易吸湿的与不易吸湿的分开来。常用的放在醒目、易于获取的位置。可能在一定条件下发生爆炸的危险品、有毒的试剂原料单独存放。
低温冷藏的要注意两点:一是不要把该冷冻的来冷藏。一般而言,冷藏的是不会结冰的,因为温度一般是在0~4度之间。当然,这是指部分含水的试剂原料而言。二是一般冷藏的试剂原料是不是太稳定,但又不能冷冻怕失去或降低活性的一类物质,故一般需要尽快使用。
普通冷冻一般是指置于0度下。低温冷冻一般是指-20度保存。这两种保存方式一般适于一些酶类等在室温下不稳定的物质。注意冰箱不要关闭不严,或者短时间内反复开启,导致试剂原料失活。再者就是浆箱除冰时要预先进行转移至相应的同等条件下暂时贮存。
深低温保存一般适合于需要在较长时间内保持活性的物质。对试剂原料而言,一般较少有这种情况。因为试剂原料中固体占大部分。而固体一般的降解是比较慢的。倒是用于保存实验标本时用得比较多。
按其毒性,有无毒、低毒、中等毒性、剧毒几种。这就要求我们在使用或者存放之时要注意防护。
对于毒性原料,首先是要了解其毒性的机制,做到心中有数。有的是产生刺激性,如:红肿、灼痛等一些不良反应。有的是产生血液毒性,如:苯,对粒细胞有影响。有的是神经毒性,如:丙烯酰胺单体。有的是致癌,这是我们感到最为担心的。如:EB,即溴乙锭;PMSF,苯甲基磺酰氟,是一种常用的蛋白酶抑制剂;乌拉坦,常用的一种麻醉剂,亦有一定的致癌活性。 第二,要知道如何防护。包括拿取、配制时,都要注意。一般我们可以戴一次性手套。第三,要知道如何处理不幸染上这些原料。每种物质都是可以清洗的,只要发现得早,且没有入口中,基本上可以自行处理。如:大量水清洗,适当选用洗涤剂,用特效物质进行减毒的处理等等。第四,要知道这些物质使用后的排放处理方式。不要对社会造成大的污染。
上面我们谈了按要求贮存试剂原料的问题,下面我们再来说一说试剂原料包装的一点常识。
如何在试剂拿到手时判断试剂有无问题?包括包装破损与否?是否正规厂家生产?是国外原装进口还是国内分装?其形态是否符合我们的要求?运输途中是否有特殊要求?规格是否符合我们的要求?
一般获取试剂原料有四条途径。一是自己去试剂供应点购买或者领取。一些常用的试剂有些学校或科研单位有一个试剂库房,可办好相关手续后领取。有些可自己去试剂原料店购买。这些可以当面看清包装标识。二是由试剂销售人员送货上门的。基本上也可以做到无误。三是邮购的。大多由特快专递送过来。要查验后确认。如有不对,可再联系供应商。四是由别人馈赠的。这一点,我们通常要注意问明,最好是查看原包装的标签。尤其是一些生化试剂,要注意是否过期。
看试剂原料的包装。无非是看厂家、批号、规格、数量。不同厂家的试剂效果可能不一样。不同批号也可能有差异。规格也是蛮重要的。要量体裁衣。不要过多地浪费试剂。但又比实际用量要多出一些,因多次取样后会损失一些。有时送货人疏忽,少送了东东,也是很麻烦。对于有几层包装的试剂,要注意小包装数量是否足量。
以上是对试剂原料给大家的一些建议,务必在做实验之始,对这些慎密地考虑,并严格按要求保存好原料。
第三,试剂的溶解度。
这是对大多数固体试剂而言。如果是液体试剂,则就要看它能否有溶剂中混匀或者分散。
一般而言,我们可以把试剂分为易溶性和难溶性的两大类。又可分为脂溶性的亲水性两大类。
下面我们就来谈谈如何配制这些试剂。
易溶性的:像绝大多数的酸、碱、盐类试剂,都是易溶性,且一般是水溶性的。这类试剂很多是用双蒸水配制的。
难溶性的:难溶性的有的是脂溶性比较高的,可以用油来配制。但有时候不能用油,但又要混匀,这时我们只好加助悬剂或者增溶剂,或者用潜溶剂。助悬剂,如:羧甲基纤维素钠(CMC-Na);增溶剂,如:泊洛沙姆188;潜溶剂,如:乙醇。也有少数用DMSO来配的。DMSO号称万能溶剂。但实际使用时,要考虑可能引起一些药理效应,从而对实验结果产生干扰。能不用尽量不用。
在配制难溶性物质的时候,有的可以加加热,有的可以搅拌,有的可以用超声。要特别注意不要盲目加热。一是有些物质一加热就变质了,产生了分解产物;二是有些物质加热就失效了,如一些酶或蛋白质类的物质。
有些物质的溶解性是我们所熟知的。配这类物质的时候自然就轻车熟路了。但是,有些试剂我们并不知道。该如何弄呢?方法有三。一是查看试剂包装的说明。一般上面会有一些信息。二是上网查询。google上找到的网页或是论文都可以。三是要试。可以用小剂量的试试。看看溶解度如何。我曾经一次用丙酸睾酮注射液,想要稀释,便用双蒸水来做。结果发现根本不混溶。因说明书上没说明是什么溶剂配的,当时看到是十分澄清的,没有细想。后来改用植物油稀释,效果不错。
有时候,我们学药理的中可能有些化学好一点,觉得从结构上来看就知道其溶解性的规律。但往往会因为过于自信而忽略了一些特例。像盐酸小檗碱,从结构上看,应是水溶性很好的。然而,实际却基本不溶。淫羊藿苷,想一想,苷类都有糖基,极性大,总是能溶的吧?却几乎不溶于水,而溶于乙醇、甲醇中。因此,物质的溶解度如何,除了查阅相关的资料外,其实很重要的一点还是要自己动手配制一点预试一下。
值得注意的是,乙醇是一种非常好的溶剂。通常与水以不同浓度混合,有时可达到比较满意的效果。
第四,我们来谈谈配制试剂的常用溶剂或者分散介质。
应该说,这是大家比较熟悉的一个问题。
常用的溶剂或分散介质不外乎以下几种:水、有机溶剂、复合溶媒、缓冲液。
水,是用得最广泛的溶剂。配制试剂,当然不能用自来水,至少也是蒸馏水。最好是用双蒸水。双蒸水实际上就相当于注射用水的要求了。双蒸水可以达到无菌、无热原的要求。配制水溶性的试剂时,要注意相关容器的洗涤、灭菌。注意量器不能高温烘烤,不然可致形变而量得不准。如:量筒、量杯、容量瓶。这类玻璃容器一般都是用重铬酸液浸泡,再洗涤。
有机溶剂,是许多试剂中必不可少的。用理较多的是乙醇、甲醇、丙酮、氯仿这三种。除有时候用到乙醇外,其余很少用来作为动物口服药物的溶剂。多用分析纯。当然,做液相检测时,要用色谱纯。有时候,这些溶剂不需任何配制,本身就作为试剂来使用。如:用甲醇沉淀蛋白。做PCR时,用氯仿除蛋白。用乙醇进行洗涤等。要注意有机溶剂的易燃性和毒性。一是防操作不当而起火;二是要进行一定的防护,如:带口罩、一次性手套等。要注意甲醇对眼睛的毒性,氯仿对肝脏的毒性。尽管这些毒性远不如致癌的试剂毒性大,但也不可忽视。
复合溶媒,通常是指乙醇等亲水性较强的溶剂与水互溶形成的混合物。丙酮亦可,但少用。有些试剂用一定浓度的乙醇来配效果比较好。注意,如果要较为精确地测定乙醇浓度,最好还是使用酒精比重计。
缓冲液,严格来说,算不上溶剂,只能算一种分散介质。但在药理实验中,又是广泛使用的。这是因为,有些试剂必须在一定的PH值条件下才能稳定。最常用的莫过于磷酸缓冲液(PBS)了。而且PBS又可配成不同的PH值。此外,就是醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸缓冲液了。前面述及的STZ,必须在PH4~4.5之间才能稳定,故而要用缓冲液配制。同时,一些缓冲液是用于洗涤或暂时保存组织的溶液系统。如 :取组织标本时,通常要用生理盐水或PBS来洗涤血迹。还有,像电泳缓冲液,是进行蛋白电泳或DNA电泳不可少的介质。配制缓冲液时,要注意如下事项:1。严格按照说明进行。主要是加入溶液中的物质的顺序。因为顺序错了可能产生沉淀或其它现象而导致不能使用。二是要准确测量PH值。三是一定要写好牢固的标签。本人配制蛋白电泳缓冲液时,有一次将浓缩胶缓冲液与分离胶缓冲液恰好弄反了,导致失误。二者仅仅是因为其组分的比例不同,而PH不同。贴上醒目而牢固的标签就容易识别。
第五,我们来谈谈配制试剂中衡器、量器及其它器具的选择。
我们知道,试剂的原料大多数情况下是固体,少数的一部分是液体。固体的配制要用到衡器和量器,而液体原料的配制需要量器,也有少数要用衡器。在配制过程中,要使试剂符合我们的要求,还要用到如:玻棒、磁力搅拌器、PH试纸、分液漏斗、滤纸等器具。
下面我们就来谈谈这方面的问题。
A 衡器的使用
试剂中一大部分是固体。将固体配制成试剂时,通常要用到衡器。衡器一般是天平。尽管有比较准确的量程小的杆秤,但那是药店里用的。
天平有不同的工作方式的,如:普通托盘天平、扭力托盘天平、光电机械天平、电子天平。普通天平一般用于粗略的称量,大家都很熟悉;扭力天平也使用简单;光电分析天平现在用得较少。下面着重介绍一下电子天平。
天平有不同的精密度的,如:准确到1g的、0.1g,1/100g,1/1000g,1/10000g, 1/100000g的。这样,我们要注意所称量的原料要达到什么样的要求,选择合适精密度。要求精确到0.01g的选择0.1g的显然不当,选择1/1000的尚可,但要用1/10000的就没必要,也不太合适了。
天平的量程。每一个天平都有它的量程范围。超过或接近最大量程,都是不妥的。当然,小于其最小量程是称不出来的。这在使用之前一定要看清。
天平的调水平。调水平是在使用天平之前必须要做一个工作。其大前提是:放置天平的房间要控制温湿度,放置天平的台子要平。要认真阅读说明书来调平。看了说明书再来调可以使我们省去不少时间。水平仪在天平的正后方,视线要与其垂直,视水平仪水泡置于正中之时,即可。要细心、耐心地调好。切忌动作粗暴。
天平的使用注意事项。除去上面对精密度、量程、调水平的了解外,我们还要注意称量过程中的一些总是。一是预先插电几分钟,至电子天平的屏幕显示稳定后再称量。二是配制时,除极少数特殊情况外,一般是从侧面加入试剂原料。三是称量辅助器具。称固体一般可用称量纸,也可用容器;称液体要用容器。四是称量剩余的固体及不小心洒落的液体要清除干净。固体以毛刷刷去;液体可用吸水纸吸干,并更换纸轻拭。
对于固体,一般要尽量以小勺捣至成粉末或小颗粒,再以牛角勺轻抖至称量纸上或容器中。对吸湿性强的固体,尤其注意环境中的湿度,并迅速完成称量。对于少数液体需称量的,多以滴管或移液器来添加。固体有的是结晶状的,结晶有多种形态,像针晶、柱晶、小鳞片状晶等等。有的是颗粒状的;有的是块状的。其中,针晶、柱晶等流动性比较好,倾倒出来称量的时候比较方便一点。而鳞状的、颗粒状的要注意小心称量。因为一般倒出来的试剂是不允许倒回原瓶的。而多余的另装则可能保质期难以保证。所以,称量原料时要注意小心谨慎,不能浪费太多。
B 量器的使用
量器主要有:带刻度烧杯、带刻度试管、带刻度吸管、量杯、量筒、容量瓶、移液管、移液枪、微量进样器。
前面四个都是比较粗略的量器,基本上只作一个估计值。对于一些不需精确浓度的试剂的配制是可行的。
量筒有大少不同的规格。根据情况合理选择。在一定范围内,可以配制任何容量大小的溶液,是配制溶液中最常用的量器。
容量瓶比较精确。但不能配成随意的容量。它只有一些定量的大小规格。如:10ml,25ml,50ml,100ml等等。多用于配制标准品溶液。有无色和棕色玻璃的。
移液管是比较精确的。有多种规格。使用时要用洗耳球吸取,放下时由手指来控制其放出的容量。这个需要进行一定的适应性训练。熟能生巧。在今天广泛使用移液枪的情况下,我们也应看到移液管在某些方面的优点。熟练掌握将为我们的实验提高不少效率。
移液枪是近些年来在实验室广泛使用的量器。尤其在一些微量溶液的吸取,在需要严格避免污染的一些实验中,起到了不可替代的作用。使用移液枪要注意枪头与枪的配套,要注意吸取时不要把液体吸入枪内。要小心调节枪的刻度盘。要注意不使用时调节至最大量程。使用时要定期校正。有进口的和国产的。进口的质量较佳。
微量进样器也是一个精密的量器。多用于液相的进样,蛋白电泳的进样。它的特点是:微量,使用时能插入到仪器之中或一定的液面之下。量程有20ul, 50ul,100ul不等。要注意使用时不要让其前端的金属长嘴弯曲,不要让不溶物堵塞,不要把活塞杆拉出来。用后可以乙醇液、蒸馏水洗涤,置于专用盒中。
注意,玻璃量器均不能以高温烘烤,以免容量不准。只能吹干。移液枪、微量进样器按说明书要求维护。
C 其它器具的使用
烧杯的使用 在配制试剂时通常要用到烧杯。尤其是一些需要加热的试剂,通常是用加一部分溶剂(通常是水),使之全部溶解,再加溶剂补足。要注意烧杯的大小,加热时要垫石棉网,加磁力搅拌器的搅拌子的大小要适宜,倾倒时不要漏液。
玻棒的使用 玻棒是用来搅拌的,主要是使固体原料尽快在液体中溶解。要注意的是,不要让玻棒触底、触壁,要让溶液全部旋转起来,而不要有死角。有人经常用玻棒把烧杯搅得哗啦哗啦响,以为如此就溶得快,其实这样易把烧杯打破。更有甚者,把温度计当玻棒用,那是很不应该的。
磁力搅拌器的使用 一是要注意搅拌的速度适宜,搅拌子在溶液中要有效地转动。二是要注意是否加温。有此对热不稳定的不可加温。
漏斗的使用 有些试剂配制后要求过滤方可作用。要注意加液时不要滴到滤纸外,务必滤除细小不溶物。
PH试纸的使用 有些溶液需要调PH值的。对于一些要求不是特别高的溶液,可以用PH试纸。要注意选用试纸的PH范围。并在液体滴到试纸的第一时间来比色。多以玻棒蘸取。测试一次后玻棒要洗涤方可用第二次。
PH计的使用 有些对PH 要求比较精确的溶液是用要PH计来测定的。要注意保护好电极。不用时多以氯化钾饱和溶液来保护电极。这方面,有专门的书可参考。
第六,我们来谈谈 配制好的试剂的使用和保存
这个问题在前面讲到原料的保存时已提到过一些。只是,与原料相比,配制好的试剂一般是液体或混悬液,保存方面更应注意。既已在前面有所述及,这里关于保存就不详述了。只提一些应特别注意的地方。
一是配制试剂的容器的选择。通常我们会选择身边一切可利用的容器。用得比较多的是玻璃瓶。小的有青霉素瓶,又称西林瓶。极少量的试剂可以用子弹头型的Doff管来装。大一点的有输液瓶,有100ml,250ml,500ml的不等。酌情使用。比较大的可用装蒸馏水的瓶子,一般有1升到5升,甚至10升的。有时也可用一些高分子材料的瓶子装试剂。这样的瓶子一般我们是用来装些有毒的试剂。因为用完了就可以丢弃。像玻璃瓶倒好像有些舍不得。在买一些试剂盒的时候,我们通常能得到一些这样的瓶子。不妨收集起来,很多时候能派上用场。
二是标签。贴标签是个必不可少的工作。有人喜欢用记号笔写上标签。要注意有油性笔和水性笔两种,前者写出字较牢固,不易洗掉;而后者通常一沾水就踪迹全无。所以注意要用油性笔写。但此法有个缺点,就是下次用此瓶配其它试剂时,字迹不易洗掉,有些麻烦。也可以在纸上写好,然后贴上透明胶。通常我喜欢用宽带的胶,这样可以把整个标签纸都盖住,即使沾了水,也不会对字迹有任何影响。也可以在医用胶布上写上字,贴上去。不过这种方式有时亦可被水弄得字迹不清。这几种方法可酌情选择。
要特别指出的是,标签上一定要写上日期!这样,可以让自己能知道试剂配了多大时间,如果出现问题,有一个证据。也可以让别人知道其大致是否在有效期内。
三是浓度的准确性。浓度要准确,要注意几点。一是正确选择量器。像配对照品溶液,一般是用容量瓶,而且要选合适的规格。配一般的试剂,用量筒。切忌不要用量杯。量杯是很粗略的量器。配体积小的溶液,通常要用移液枪,或微量进样器。二是有些量特别小的试剂(通常是5mg以下),可以直接在其贮存容器里加溶剂。如:PCR、蛋白电泳中某些试剂就是极微量的装在Doff管中,甚至基本看不见。有些在配之前还要高速离心,便极微量的粉末沉积于管底。不然,一打开盖,试剂粉末就损失掉了。三是要注意配好的试剂要冷却到室温最终量取体积才是准确的。如:有些试剂在配制过程中要加热至沸腾,溶剂损失不少,要待其冷却至室温再加溶剂补足。
四是有关特殊要求。有的试剂配制前要加温。如:冰醋酸在温度16度以下,是结成冻块了,要缓缓加温后使用。DMSO也会出现类似现象。有的试剂配好后要求遮光。可选择黑纸或者黑塑料来包裹。有的试剂不是用水来配,而是要别的溶剂。如:PMSF,要用异丙醇来配制。而且是用时再加入水中。因其在水中会较快失效。有的试剂是要求配好后要过滤的。要注意取续滤液。如有失误,宜反复过滤直到符合要求。试制配好后大多数是要求冷藏的,且尽快使用。但也有要求冷冻的,视其具体要求而定。有的试剂是极易氧化的,通常要加抗氧剂。如:6-羟基多巴胺(6-OHDA),通常是用0.2%维生素C水溶液来配。
关于试剂的使用,我只谈谈原则上的一些注意事项。
一是配好后尽快使用。配好的试剂因大多以液体形式存在,其保质期较原料试剂要短,易失效。因此,要规划好实验后,再开始配试剂,不要把试剂配好老长时间了,才开始做。
二是要注意反复取用试剂时,不要污染。以移液枪取液时,注意更换枪头。以移液管取液时,注意要洗涤,多余的液体不要返回瓶内,而应放掉。
三是在同一个实验中不要用不同批次的试剂。因动物实验中,讲究的就是齐同对比。如果用不同的试剂,结果出来就不知道是什么引起的差异了。所以,配试剂时,尽量配足量,宁愿在一次实验后有剩余,而不能不足。
四是使用别人配制的试剂时,一定要弄清楚来源及相关信息。在同一个实验室,做同一类实验时,我们通常会共用一些试剂。这时,我们一定要注意问清楚。不然,实验出了问题就亏大了。如:做蛋白电泳时,所用的缓冲液,过硫酸铵,丙烯酰胺,都是相同的,只是临用时的配比不同。要注意不要用过期的试剂。
五是试剂用完后,相关器具要洗涤。有些是必须取完后立即洗涤,以免别人或自己在污染的情况下误用。如:丙烯酰胺溶液,有毒。有些是在一小段落后将所用器具洗涤干净。有些残留液体不洗,时间稍隔长一点,就比较难洗了。这是我们应当注意的。在一些实验室,因有一些人要共用一些器具,尤其要注意这一点。就像吃完饭要洗碗一样。这也应是一个良好的实验习惯。
第七,我们来谈谈试剂保存中的常见问题及解决方式。
配好的试剂,在保存的过程中,或多或少会出现一些问题。有的稍加处理即可,不影响使用;有的则不能继续使用,甚至产生毒性。因此,了解试剂常见的一些可能变质的现象,有助于我们掌握一般规律,并能顺利解决实验中出现的问题。
A 物理性质的变化
最常见的有:产生沉淀或结晶、产生絮状物、颜色变化、黏度变化、产生霉菌、产生气味
产生沉淀或结晶:最常见的是一些缓冲液,当温度比较低的时候,可能有些物质是饱和溶液,低温可使其析出。当恢复至室温时,即溶解。比如,我有一次配含氯化锌的多种离子的溶液,打开冰箱发现有沉淀,置室温下摇匀后,已澄清,不影响使用。考马斯亮蓝如配制不当,即有可能出现蓝色沉淀。一般来说,酌情调整其的中乙醇浓度可以避免。
产生絮状物:有些物质在低温下析出成絮状,一般不影响使用。但要仔细观察,如絮状物是其它物质,或者是菌丝,则不可用。对于含水用含糖的溶液尤其要注意。
颜色变化:这一变化可能是在配制过程中加温后,过一段时间出现的;也有可能是贮存过程中受光照所引起的;也有可能是溶液中各物质相互作用所引起的。一般是颜色变深。如:有一次我配一个新化合物,由于事先不了解,加温快速溶解,置冰箱后,第二天发现出现黄色。后经询问合成此化合物的人员,说在60度以上不稳定。也有可能是颜色变浅。如:一些染料溶液。
黏度变化:主要是一些高分子物质的“溶液”。其实高分子是分散在其中,不是真正的溶解。如:明胶溶液,配制时间过长,有的就会变稀,这可能是明胶的质量问题。
产生霉菌:常见于含水的,含糖分较高的一些溶液。主要是保存不当所致。一般而言,配制过程中注意操作,配好后置冷藏,短时间内是不会出现霉菌的。
产生气味:这主要是可能溶液中的物质相互反应产生了一些气体,或者本身溶解其的中气体跑了出来,也有的是本身固有的气味变化。如:产生氨气气味、失去醋酸气味等等。
B 化学性质的变化
如:PH的变化、失去氧化性、失去还原性
PH的变化:当怀疑试剂出现问题的时候,我们可以测一下其PH。如不在正常范围内,即可认为已变质。
失去氧化性:有一次用浓硫酸做蒽酮-硫酸法测多糖的含量,发现配好的试剂没有反应,没出现应有的颜色。于是把浓硫酸取一滴滴于报纸上,发现根本没有像往常一样将报纸碳化。固此硫酸已不可用。这可以说是用通过简单的观察来判断试剂有无变质。同样,像双氧水等一些强氧化剂可通过类似的检测来判断。
失去还原性:像维生素C 等还原性物质,当变质时一般有颜色变化。
C 生物学性质的变化
如:酶失活、生物分子降解等
这种变化并不是一下就可以看出来的。往往是做实验中,或者是实验做完后结果不如意时,才会考虑可能是试剂出了问题。关于这一问题,我们将在“如何追溯实验中试剂的问题”章节中具体探讨。在此不作赘述。
如何解决试剂保存中出现的问题呢?
一般而言,除少数不影响使用的现象外,试剂都得重配。
第八,我们来谈谈有毒的、危险的试剂的配制及保存。
首先,我们来了解一下毒性的基本常识。
按其作用时间长短,可分为:急性毒性和长期毒性
按其作用的分布,可分为:局部毒性和全身毒性
按其作用部位及机制,可分为:
脏器毒性:如:氯仿有肝毒性;SDS粉末可沉积于肺;等等
血液毒性:如:苯有血液毒性
神经毒性:如:丙烯酰胺有神经毒
致癌:如:溴乙锭可致癌,乌拉坦可致癌。
其它毒性:如:过敏、皮肤刺激等
对我们而言,了解其毒性机制是很重要的。这样,我们就知道如何防护,也知道在万一沾上有毒试剂时该如何处理。
对于局部毒性和一些脏器的慢性毒性,我们往往是不会特别地担心。但对于导致血液、神经系统的毒性,以及致癌的毒性,却是我们感到最恐怖的。事实上,只要我们做到了安全防护,基本上也没有多大问题。即使对于一些致癌物,我们也应该胆大心细地使用。我们的身体也不是那么脆弱的,还有免疫系统在起作用。
但,做好必要的防护工作是最重要的。
下面我们来具体谈一谈如何在配制毒性试剂过程中防护自己。
1 要了解试剂的毒性机理。这是防护的一个基本前提。一般标明有毒性的物质,其机理大多清楚。这样,我们对于毒性试剂心里有个底。像对于氯仿这样的溶剂,我们知道其长期应用可致脂肪肝。但平常用的时候偶尔洒一点到皮肤上,我们清洗即可,也就没有多大的担心。双氧水,浓度不高的话,万一有一点弄到皮肤上也不是很担心,只是可能会脱掉一点皮。但不至于有生命之虞。相反,如果滴上一滴致癌的试剂,那我们就会感到很恐怖了。因此,了解其毒性机理,我们就会面对试剂心中有数,不至于太不重视,也不至于过分担心。
2 要了解常用的毒性物质的性状及预防措施 针对不同毒物,我们有不同的措施。如:毒物为挥发性物质,我们可考虑戴上防毒的面具,在有通风机械的地方配制,配好后盖紧;对易扬起粉尘入肺的物质,我们戴口套,并尽可能轻拿轻放;对于易致癌及有潜在致癌物质,可戴一次性手套。
3 了解中毒的症状 不怕一万,只怕万一。我们常常不可能百分之百不接触到有毒物质。了解中毒的一些症状是很有必要的。如:有的有红肿、疼痛、眼刺激性、特异性恶臭等。接触到皮肤的话,一般情况下我们是用大量水清洗。严重的话,要去医务室或医院处理。
在了解上述知识的基础之上,我们来讲一下配制毒性试剂的注意事项。
第一,毒性试剂的容器要专用,并有醒目的标志。很多毒性试剂,我们用高分子材料的瓶子,除非一定要用玻璃瓶。因为玻璃瓶总是被人重复利用,担心有人在不知情的情况下误用装过有毒试剂的瓶子。通常标签我们用红色的,标明“有毒!”,必要时画上毒性的符号。
第二,配制毒性试剂的防护。一是一般要戴一次性手套,必要时戴口罩及防毒面具。二是,试剂不要接触到容器的外壁。因为试剂沾到外壁上以后,每次拿取都要戴一次性手套。这样,有可能不小心用沾了有毒试剂的一次性手套接触了其它瓶子,扩大了污染的范围。我们的做法通常是,如果外壁有沾染,立即更换一个瓶子。这样,就可以直接用手拿瓶壁外,而不担心。拧开盖子时,盖子一般宜朝上放置,这样也可减少污染范围。三是配制完毕,污染物及时投放到指定地点。包括沾有毒性试剂的瓶子,手套,及其它一次性使用器具等。四是长期接触有毒试剂的器具要放在专用的范围内。如:做PCR的电泳槽,长期接触到电泳液,EB等,须固定在一个范围内,不要到处乱放。这样就能尽可能地减少污染。
第三,配制毒性试剂要按程序来配,注意与其它试剂反应产生致癌物的试剂。如:PCR中常用到的试剂焦碳酸二乙酯(DEPC),可与氨反应而产生致癌物。但通常我们在用其浸泡Tip头后,使其挥发掉。DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。这里,实际上所说的,是一些潜在致癌物。要注意在使用过程中的配伍禁忌。
此外,我们来略述一下危险品试剂的配制。
这里所指危险品,主要是指在一定条件下可发生爆炸的物质。如:乙醚、苦味酸、苯胺等。
对于危险品,我们一般就是低温、避光、在规定情况下使用。注意激发其爆炸的条件。
第九,我们来谈谈配制试剂的优化。
一般而言,我们总是会严格按照参考书、文献或者是试剂说明书上的步骤来配制试剂。但有时候,这些步骤让我们觉得有些繁琐。这样我们就会思索该如何改进?如何又快又好。要达到这样一个看似高于一般实验的标准,需要些什么样的要求呢?
首先,必须是你对试剂的原理及可能出现的问题有全面的了解。
其次,实验中有必须要改进的因素存在。
第三,要有小量的试配的经验。改进一个方法不是一下就能做得到的,而是要不断、反复地摸索。
关于配制试剂的优化方法,主要有以下几种:
1 配混合试剂 有时候,我们用试剂作检测时,要配几种试剂,而要不断地把几种试剂顺序地加到样本之中。每次加的时候,因为一次误差,可能各种试剂的比例有差异。尤其是一些检测酶类的试剂。但如果我们知其原理,就可以配成混合液,一并加入。比如,做酶的反应方面的实验,底物及其缓冲液可能是好几种试剂,一般可混合后一并加入,然后再加酶。这样一是可以减少误差,二是节省时间。
2 适当改变浓度 试剂说明书上,以及做某一具体实验的方法步骤上,一般都会写明试剂要配成什么样的浓度。但这并不是说,完全不可以变化的。有时候,因为实验条件的不同,完全按书上的方法去配成试剂,甚至做不出实验结果。那么,什么样的情况下,可以改变试剂的浓度呢?也就是说,不按书上或文献中的,自己来改变呢?那前提就是:你必须知道方法的原理。比如:做蛋白电泳,用考马斯亮蓝染色时,有时我们会发现没染上。这时可以考虑增加考马的浓度,或者增加蛋白的上样量。又如:给动物灌胃时,我们知道每种动物的容量是有一定的。而我们的给药量是不同的。这样,就要根据不同的情况来调整浓度,不要硬搬书上或文献中的浓度。再者,像考马测蛋白含量的时候,只要考马与蛋白量的比例是一定就可以了。在试剂不很足的情况下,可以把试剂和标本蛋白量都减至2/3,甚至一半,同样可以测出蛋白含量,只要浓度在它的检测范围内。凡此种种,不一而足。因此,在对实验原理及步骤很熟悉的情况下,实验中可不拘泥于书本,完全可以自行掌握。
3 适当省略步骤 对于一些浓度要求不精确的溶液,配制时可酌情省去一些步骤。这个因人而异。我想在实验中是有不少这样的情况的。
4 改进试剂的配方 其前提是对实验原理非常了解。我曾经改变过考马斯亮蓝的配方。刚开始做蛋白电泳时,按《分子克隆》上的配方来配,老是染不上色。很纳闷。摸索一番之后,发现有可能是考马的问题。因蛋白上样量已经够高了,不能再增加了。于是自己动手来改考马的配方。发现,只要增加考马液中的甲醇的比例,就容易染上色,且牢固。于是,在原配方的基础上,我配制了几种不同的考马液,试了几块胶。选择一种既能染上色,又能使蛋白带的深浅较好的分出来的一种浓度。这就成了我实验中的最佳浓度。很多时候,各个实验室的条件不一样,所用试剂就得有所改进。书本上的只是一个大概的标准。要灵活变化。
5 寻找代用品 有时实验中用到的东东不一定能及时找得到。有的可能通过别人赠送,有的可以邮寄。但有些不是很常用的试剂确实一时找不到。那么,是否根据实验的原理用别的试剂代用一下呢?我觉得是可以考虑的。但前提是,基本不影响实验效果。这需要实验做得很熟练,且对某具体实验步骤、原理十分了解的情况下方可如此。一般情况下不推荐此法。