结直肠癌是常见消化道恶性肿瘤之一，近年来，发病率呈上升趋势。在美国，结直肠癌在男、女性癌症发病率和病死率中均居第3位。肿瘤的发生、发展过程涉及多种癌基因、抑癌基冈表达和功能的改变，研究证实肿瘤抑制基因启动子区CpG岛甲基化致基因失活是肿瘤发生的重要机制之一。APC基因是一种抑癌基因，是惟一在结肠上皮细胞增殖中起看门人(gatekeeper)作用的基因，其失活为细胞异常增殖所必需，散发性结肠癌中APC基因体细胞突变率在80％以上，有研究发现APC基因启动子区CCAAT盒周围CpC岛甲基化可通过改变染色质构象和干扰转录因子与CCAAT盒的结合而抑制基因表达  MLHl基因属错配修复基因，其启动子近侧区（与转录起始位点相关）CpG岛甲基化与基凶表达缺失密切相关,MLH1失活所致的微卫星不稳定(MSI)参与了散发性结直肠癌的发生、发展。因此，检测APC、MLH1基冈启动子区甲基化状态可能有助于早期发现有癌变倾向的细胞，本研究旨在比较实时荧光定量PCR(FQ-PCR)与甲基化特异性PCR(MSP)检测基冈甲基化状态的差异，并分析APC.MLH1基因甲基化与结直肠癌临床病理特征的关系。
　　

材料与方法
　　

一、标本来源
　　

收集2008年2月～2010年3月于南京市鼓楼医院接受外科手术治疗的66例结直肠癌患者的结直肠组织标本，其中男39例，女27例，年龄23—86岁，平均(62.7+10.8)岁，所有患者术前均未行放化疗．诊断经术后病理检查证实癌组织取一手术切除标本肿块巾心的非坏死组织：癌旁组织（随机取20例）取白距肿块边缘至少10cm处．光学显微镜下未见癌细胞浸润。癌组织和癌旁组织标本石蜡包埋，7μm厚连续切片，取4片常温保存于1.5 ml离心管巾，、组织获取经鼓楼医院伦理委贝会批准，患者或家属知情同意。
　　

二、主要试剂和仪器
　　

石蜡包埋组织切片基囚组DNA提取试剂盒，PCR试齐盒，PCR引物参照文献中序列，业硫酸氢盐修饰试剂盒，甲基化阳性对照。
　　

FQ-PCR仪,PCR仪，凝胶成像系统。
　　

三、方法
　　

1．组织DNA提取：石蜡切片二甲苯脱蜡，充分去除二甲苯,37℃烘干提取基因组DNA,紫外分光光度法测定DI\A浓度和纯度，置于1.5 ml离心管巾,-20。C保存备用，保存时间不超过6个月。
　　

2．FQ-PCR：取1μDNA行业硫酸氢盐修饰，-80℃保存备用，保存时间不超过1个月．以经亚硫酸氢盐修饰的CpGenome Urliversal Methvlaled DNA作为甲基化阳性对照，以经亚硫酸氢盐修饰的正常人外周血淋巴细胞DNA作为甲基化阴性对照。
　　

标准品制备和标准曲线的建立：紫外分光光度法测定甲基化阳性对照DNA浓度和纯度．以双蒸水为溶剂10倍梯度稀释，使其浓度依次为1500、150、15、1.5、0.15、0.015、0.0015 ng/μl,4℃保存备用，按每拷贝基因组DNA约3 pg计，行FQ-PCR时，分别加入2μl标准品，相当于10^6～10^0拷贝数。以不同浓度甲基化阳性对照DNA为反应底物，根据浓度梯度，以Ct值为横坐标、标准品拷贝数的对数值为纵坐标制作标准曲线。
　　

3．MSP：取1μg DNA行亚硫酸氢盐修饰，-80℃保存备用．保存时问不超过1个月。甲基化引物和非甲基化引物扩增片段长度分别为98bp和108bp），参照Herman等的方法行MSP。PCR反应体系内含1O xPCRBuffer 2.5μ、dNTP Mixture μ、TaKaRa Taqm HS0.125μl、卜下游引物各0.5μl（20 μmol/L）和模板DNA 2μl，以去离子水补足至20μl。
　　

取9μl MSP产物，加入1μl lO*Loading Buffer，于含0.5 mg/L溴化乙锭的2.5%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统拍照观察。如APC基因启动子区CpG岛完全甲基化，则只有甲基化引物能扩增出目的条带；如完全未甲基化，则只有非甲基化引物能扩增出目的条带；如为部分甲基化，则两对引物均能扩增出目的条带。部分甲基化归为甲基化范畴。
　　

四、统计学分析应用SPSS 18.0统计软件．计数资料以百分比表示，组间比较采用X2检验或Fisher确切概率法，P<0.05为差异有统计学意义。

结    果
　　

一、APC、MLH1基因甲基化状态
　

根据FQ-PCR结果，66例结直肠癌组织中32例(48.5%) APC基因启动子区甲基化阳性，36例(54.5%) MLH1基因启动子区甲基化阳性，20例癌旁非癌组织中两基因均未发生甲基化，癌组织与癌旁组织间APC 、MLH1基因甲基化阳性率差异有统计学意义（X2=15.443 ,P=O.OOO；X2=18.764 ,P=O.OOO）。
　　

21例(31.8%)癌组织APC、MLH1基因同时发生甲基化，11例(16.7%)仅APC基冈发生甲基化，15例(22.7%)仅MLH1基因发生甲基化，19例(28.8%)两基因均未发生甲基化。癌组织中APC、MLH1基因甲基化阳性率差异无统计学意义(X2=3.076，P=.090)。APC、MLH1基因甲基化状态与患者性别、年龄和结直肠癌Dukes分期之间均无相关性。
　　

二、FQ-PCR标准品反应性能
　　

甲基化阳性对照可见明显扩增曲线．阴性对照则无扩增曲线。甲基化标准品浓度分别为10^6、10^5、10^4 .10^3、10^2、10^1和10^0拷贝时，APC基因Ct值分别为21.20.24.27 .26.94 、30.07 .33.02 .36.49和38.61．标准曲线相关系数r^2为0.99．熔解曲线测定特异性产物Tm值为(82.7+ -0.4)℃；MLH1基因Ct值分别为23.93 .26.50 、29.62 .32.17、34.66、37.13和38.71，T^2为0.99，熔解曲线测定特异陡产物Tm值为(77.4+ -0.5)℃。
　　

三、FQ-PCR与1VISP敏感度分析
　　

甲基化阳性对照DNA浓度稀释至1.5 ng/μl时，FQ-PCR和MSP均显示阳性结果；当浓度低于1.5 ng/μl时，MSP不能有效扩增，而FQ-PCR仍有明显扩增曲线。两者可检出的最低浓度分别为0.015 ng／μl和 1.5 ng／μl。
　　

分别以FQ-PCR和MSP检测66例结直肠癌组织的APC基因甲基化状态．MSP 28例(42.4%)阳性，38例(5 7.6%)阴性，FQ-PCR 32例(48.5%)阳性，34例(51.5%)阴性，MSP结果阳性者FQ-PCR结果均为阳性n两种方法检测甲基化状态的一致性检验K值为0.878。紫外分光光度法检测显示，FQ—PCR结果阳性而MSP结果阴性的4例标本．DNA浓度均低于1.5 ng/μl。Fisher确切概率法显示两种方法的检测结果差异有统计学意义（P<0.05）。
　　

讨论
　　

结直肠癌的发生是一个多因素、多步骤的过程，是机体内因与环境外因交互作用的结果。随着表观遗传学研究的进展，现已发现DNA甲基化对结直肠癌的发生、发展具有重要意义，表观遗传学与遗传学改变共同作用，导致肿瘤发生。因此，检测肿瘤相关基因的甲基化状态．可能为寻找新的结直肠癌诊断、预后相关生物学标记物以及治疗靶点提供依据。研究显示抑癌基因APC和错配修复基因MLH1启动子区CpG岛甲基化所致的基因表达和功能失活在散发性结直肠癌的发生、发展中起重要作用n本实验结果再次证实结直肠癌组织中APC、MLH1基因处于高甲基化状态，甲基化阳性率显著高于癌旁非癌组织，提示高甲基化的抑癌基因可作为结直肠癌辅助诊断的标记物。部分癌组织APC、MLH1基因未发生甲基化，考虑除甲基化外，还可能存在杂合性缺失、点突变等机制，共同调节基因表达，导致肿瘤发生。APC、MLH1基因甲基化状态与结直肠癌Dukes分期之间无相关性，提示两种基因失活可能均发生于癌变的初始阶段。
　　

检测DNA甲基化的方法很多．最常用的是亚硫酸氢盐修饰法，本实验所采用的FQ-PCR和MSP均基于亚硫酸氢盐修饰n经修饰后，未发生甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，发生甲基化的胞嘧啶则保持不变。MSP即为针对这两种情况，设计不同引物分别扩增甲基化和非甲基化DNA．根据电泳结果判定特定位点的甲基化情况。FQ-PCR则是在MSP的基础上，增加使用SYBR Green I染料，通过检测荧光信号的增加确定初始模板的量。MSP虽较为常用，但普通MSP存在敏感度较低、仅能作定性分    6析、电泳可造成环境污染等不足。而FQ-PCR可对DNA甲基化水平进行半定量分析．突出特点是能快速、大量筛查人类肿瘤相关基因某一特定位点的甲基化状态，可在非甲基化等位基因含量高于甲基化等位基因10000倍的情况下检出甲基化等位基因，敏感度较MSP高10倍以上。本实验中，甲基化阳性对照DNA浓度稀释至1.5 ng/μl时，FQ-PCR和MSP均显示阳性结果；当浓度低于1.5 ng/μl时，则仅FQ-PCR能得到阳性结果。分别以FQ-PCR和ISP检测结直肠癌组织的APC基因甲基化状态．MSP结果阳性者FQ-PCR结果均为阳性，两者检测结果有显著差异，因此可以认为FQ-PCR的敏感度优于MSP。然而行FQ-PCR时，标准品的制备是一个必不可少的过程，由于目前尚无统一标准，各个实验室所采用的生成标准曲线的样品各不相同，导致实验结果之间缺乏可比性。FQ-PCR实验成本较高．亦使其广泛应用受到限制。
　　

综上所述，结直肠癌组织中APC、MLH1基处于高甲基化状态．甲基化状态与肿瘤Dukes分之间无相关性；在DNA甲基化的检测手段中，FQ—PCR的敏感度优于MSP。