作者：柏海燕，魏莲花，李晓芳，师娟子，西北妇女儿童医院生殖中心

一、病例资料

患者男，３２岁，２０２２年１月２日以“婚后未育５年，男方有多囊肾家族史”主诉来我院生殖中心就诊。２０２２年１月４日精液化验提示严重少弱畸精子症，因男方因素拟行卵细胞浆内单精子注射（ＩＣＳＩ）助孕。患者及其父（６７岁）均患多囊肾（临床诊断），其母亲（６５岁）与弟弟（３０岁）无多囊肾表型。

考虑到多囊肾为遗传性疾病，最终确诊需要进行基因检测［１］。患者随即在第三方检测机构采集外周血，采用下一代测序（ＮＧＳ）与多重连接探针扩增技术（ＭＬＰＡ）相结合的方法，进行多囊肾相关基因组合检测［２－３］。ＮＧＳ方法检测到患者ＰＫＤ１基因有２个位点变异，分别为ＮＭ＿００１００９９４４．３：ｅｘｏｎ１５：ｃ．４０４９Ｃ＞Ｔ：ｐ．Ｔｈｒ１３５０Ｍｅｔ和ＮＭ＿００１００９９４４．３：ｅｘｏｎ４６：ｃ．１２５７７Ｃ＞Ｔ：ｐ．Ｇｌｎ４１９３Ｔｅｒ变异。ＭＬＰＡ结果提示，ＰＫＤ１基因３号外显子杂合缺失。根据美国医学遗传学与基因组学学会（ＡＣＭＧ）对基因变异临床意义的分类标准，结合上述变异人群频率、遗传模式、文献报道及蛋白功能影响信息，该ＰＫＤ１基因２个位点变异依据评级证据ＰＳ４＿Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ＋ＰＭ２＿Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ＋ＰＰ１［４ ］和ＰＶＳ１＿Ｍｏｄｅｒａｔｅ＋ＰＳ４＿Ｓｕｐ－ｐｏｒｔｉｎｇ＋ＰＭ２＿Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ［５－６］，均评为临床意义不确定（ＶＯＵＳ）；第３号外显子杂合缺失评级为致病性变异（Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ，Ｐ）［７］。检测报告见表１。

据人类孟德尔遗传学（ＯＭＩＭ）数据库中记载，ＰＫＤ１基因的杂合致病性变异可导致成人型多囊肾，该疾病呈常染色体显性遗传模式［８－９］。患者主要表现为肾囊肿、肝囊肿和颅内动脉瘤［１０－１１］，常见急／慢性疼痛及肾结石等并发症［１２］，约５０％的患者会在６０岁左右进展为终末期肾病［１３］。

经遗传咨询后患者夫妇决定行单基因病胚胎植入前遗传学检测（ＰＧＴ－Ｍ）助孕［１４］。遂采集家系成员的外周血标本进行家系验证并构建单体型。点突变家系Ｓａｎｇｅｒ验证及构建单体型结果提示，本例患者的２个ＶＯＵＳ点变异均遗传自其父，其无表型母亲未携带突变位点（图１）。对ＰＫＤ１基因杂合缺失变异进行ＭＬＰＡ法验证时发现，该患者携带的３号外显子缺失遗传自无表型的母亲，而非有表型的父亲（图２）。考虑到ＰＫＤ１基因与多囊肾表型关联度高且外显度较高，理论上受检者母亲携带１个外显子缺失但无表型的可能性较低，遂对上述检测结果产生怀疑，展开进一步排查。

经分析ＭＬＰＡ探针设计原理，怀疑ＰＫＤ１基因２号内含子（近３号外显子处）存在的点突变干扰了３号外显子的探针信号，从而拉低了信号值，呈现假性缺失的状态。经Ｓａｎｇｅｒ验证进一步证实，发现受检者及其母亲在２号内含子区携带了两个杂合变异，分别为ｃｈｒ１６：２１６９２１８．ｃ．２８８－３２Ａ＞Ｇ和ｃｈｒ１６：２１６９１９７．ｃ．２８８－１１Ｇ＞Ｃ，均评估为临床意义不明－偏良性（ＶＯＵＳ－ＬＢ）。经Ｓａｎｇｅｒ验证受检者弟弟发现其同样携带上述两个杂合内含子变异（表２、图３）。利用探针法验证受检者及其母亲的ＰＫＤ１基因３号外显子的拷贝数结果也显示未见明显缺失（图４）。进一步分析原检测报告中的２个点变异，针对受检者遗传自有相似表型父亲的两个杂合位点，对受检者弟弟进行Ｓａｎｇｅｒ验证，结果显示其无相关临床表型的弟弟并未携带这两个变异位点（表３、图５）。该家系中两个变异位点符合变异－表型共分离机制。

结合本例患者多囊肾家系中变异与表型共分离证据（证据等级ＰＰ１），及该受检者的临床症状和家族史高度符合多囊肾主要表型证据（证据等级ＰＰ４），给出受检者修正后的基因检测报告如下：受检者样本检测到ＰＫＤ１基因变异ｃ．４０４９Ｃ＞Ｔ和ｃ．１２５７７Ｃ＞Ｔ，ｃ．４０４９Ｃ＞Ｔ评估为ＶＯＵＳ（ＰＳ４＿Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ＋ＰＭ２＿Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ＋ＰＰ１＋ＰＰ４），

ｃ．１２５７７Ｃ＞Ｔ评估为可能致病变异（ＬＰ，ＰＶＳ１＿Ｍｏｄｅｒａｔｅ＋ＰＳ４＿Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ＋ＰＭ２＿Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ＋ ＰＰ４＋ＰＰ１）。ＮＧＳ联合ＭＬＰＡ检测ＰＫＤ１基因点变异及拷贝数变异结果显示，未检测到可以明确解释受检者表型的拷贝数变异（表４）。

二、讨论

本例患者行ＰＧＴ－Ｍ的目的是剔除携带有与其相同的致病变异基因胚胎，避免同疾病患儿出生，因此ＰＧＴ－Ｍ助孕前对致病位点的认定需慎之又慎。基因层面的检测方法有很多，均有各自的优点和局限，常见的ＮＧＳ主要针对点变异进行检测，而ＭＬＰＡ则对拷贝数变异的检测更准确［１５］。不同单基因病基因变异类型有其特异性，检测机构也需要相应个体化、采用有针对性的检测方法。针对常见高发的单基因疾病，如果需要针对大片段缺失／重复进行检测，一般综合采用ＮＧＳ联合ＭＬＰＡ方法［１６］。如常见的脊髓性肌萎缩症（ＳＭＡ）、杜氏肌营养不良（ＤＭＤ），其大片段缺失／重复所占比例非常高（ＳＭＡ为９５％，ＤＭＤ约为５０％），需要做ＮＧＳ联合ＭＬＰＡ（或者ＰＣＲ）检测，同时对点变异和缺失／重复变异进行检测。但对于苯丙酮尿症和丙酸血症等，大部分都是点变异或者几个碱基的缺失，大片段缺失／重复的比例比较低（５％左右），一般检测部门可能只做ＮＧＳ检测。ＰＫＤ１和ＰＫＤ２基因的致病性变异可导致常染色体显性遗传的多囊肾（ＡＤＰＫＤ）。根据文献资料，约８５％的ＡＤＰＫＤ患者为ＰＫＤ１基因致病性变异所致，约１５％的患者为ＰＫＤ２基因致病性变异所致，致病性变异以点突变为主，单个或多个外显子的缺失和／或重复仅约占所有致病性变异的２％～４％［４－５］。具体到本病例患者，检测机构对其第１次基因检测即很谨慎，采用ＮＧＳ联合ＭＬＰＡ综合解决方案，但仍误诊，误诊的原因与变异位点位于基因外显子边缘、引物设计受内涵子变异干扰有关。ＮＧＳ检测到内含子边缘处２个变异，因无致病性一般忽略不计，巧合的是这两个变异位点影响了ＭＬＰＡ结果。引物会延伸至外显子两端的内含子区域，如果引物结合的内含子区域恰好存在变异，则可能拉低外显子整体的杂交信号值，造成假阳性结果，这种假阳性尽管是小概率事件，但可能发生。

本病例之所以能及时发现诊断错误，幸运之处在于ＰＫＤ１基因与多囊肾表型关联度高且外显度较高，理论上其母亲携带１个“致病”外显子缺失但无表型的可能性较低，提醒我们进行反思；又有其健康弟弟的测序结果提供了进一步的验证数据。该病例提示我们，当无症状个体筛查出已知致病性变异时，除了对疾病特点进一步了解外，还需要对检测结果各方面进行探究分析，以明确检测是否准确。

综上所述，家系验证在基因诊断中具有重要性，提醒我们在ＰＧＴ－Ｍ临床工作中不能采取拿来主义、直接采信基因报告单结果对胚胎进行检测，而是应该多方评估和验证，避免落入误诊的陷阱。

参考文献略。

来源：柏海燕,魏莲花,李晓芳,师娟子.多囊肾患者辅助生殖前基因检测误诊1例[J].生殖医学杂志,2023,32(04):603-609.