作者：杨阳，陆如岳，陈琪苗，蔡莺莺等，浙江省台州医院检验科，台州恩泽医疗中心(集团)恩泽医院检验科

脆弱拟杆菌(Bacteroides fragili)是一种两端钝圆而浓染、有荚膜、无芽胞、无动力的专性厌氧革兰阴性杆状细菌，主要存在于结肠中。此外，其在呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道黏膜也可定植生长［1］ 。鸟肠球菌(Enterococcus avium)是人体胃肠道和生殖道的常驻菌群，可引起菌血症、心内膜炎、泌尿系统感染、腹腔感染等［2］ 。放线菌属(Actinomycetes)是一种条件致病菌，存在于人体的口腔黏膜、消化道、女性的生殖道中［3］，可引起肉芽肿性感染。本文报道了1例左胫骨上段慢性骨髓炎患者，在其关节液中培养出脆弱拟杆菌、欧洲放线菌和鸟肠球菌。报道如下。

1临床资料

1．1一般资料

患者男性，57岁，37年前无明显诱因下发现左胫骨上段“动脉瘤样骨囊肿”，至外院行手术治疗，术后一般情况可。2年后局部复发，至当地医院行手术及骨水泥旷置术，膝关节活动稍受限，稍跛行，无其他部位不适，并定期复查。18年前在当地医院行骨水泥去除术，术后至今一直未明显恢复，局部可见窦道，淡血性渗液，伴恶臭。现患者感疼痛明显，左下肢活动受限，无法完全下蹲，上下楼梯费力，无交锁，无异常弹响，无明显晨僵，无四肢关节游走性疼痛，无畏寒发热，严重影响日常生活，为进一步诊断与治疗，于2023年4月29日到我院就诊。查体:体温36．5℃，脉搏54次/分，呼吸16次/分，血压168/92 mm Hg。既往体健，有高血压病史10年余，规律服药，否认其他疾病史及家族史，否认药物、食物过敏史。

专科检查示左胫骨上段见陈旧性手术瘢痕，可见窦道，淡血性液渗出，伴恶臭，左下肢活动稍受限，行走跛行，肢端感觉活动血运可。抽取关节液标本，送检细菌培养。X线检查示:左胫骨上段骨质破坏、前缘骨质缺损，慢性骨髓炎?

1．2实验室检查及诊疗过程

2023年4月29日入院当天查白细胞计数10．0×109/L，中性粒细胞占比63．6%，C反应蛋白(CＲP)9．4 mg/L，红细胞沉降率(ESＲ)42 mm/h，IL-613．15 pg/m L，IL-10 2．61 pg/m L。结合病史、专科检查及辅助检查，初步诊断为左胫骨上段慢性骨髓炎及左胫骨上段骨缺损。5月2日在气管插管全身麻醉+神经阻滞麻醉下行左侧膝感染扩创+胫骨上段瘤段切除+膝关节重建+负压引流术，术中取左膝前内侧切口，长约30 cm，注射器抽取关节液标本，术中的关节液分别注入血培养瓶需氧、厌氧各两瓶进行增菌培养，同时送检宏基因二代测序(metagenomic nextgeneration sequencing，m NGS)明确病原体。术中左上段胫骨感染组织送病理检查。术后予万古霉素针1 g静滴q12 h控制细菌感染，万古霉素0．5 g qd和美罗培南0．5 g qd外用冲洗加强局部抗感染。

2023年4月29日送检的关节液直接细菌培养结果提示为鸟肠球菌和欧洲放线菌。5月3日，患膝稍肿胀，患者有反复发热，关节液的血培养报阳后涂片染色见有革兰阴性杆菌及阳性球菌。遵感染科会诊意见，根据关节液细菌培养结果进行经验性抗感染治疗，停万古霉素针，予美罗培南针0．5 g静滴q8 h、利奈唑胺针0．6 g静滴q12 h抗感染治疗，同时加用利福平片0．45 g qm增强抗感染。

2023年5月8日，术中送检的关节液血培养增菌培养报告结果为斯氏普罗威登斯菌和鸟肠球菌。术中感染组织的病理检查结果报告(图1)示:左上段胫骨符合慢性骨髓炎，左胫骨感染组织符合皮肤窦道，伴周围多量急慢性炎细胞浸润。

术后第13天，每日换药时予美罗培南0．5 g联合万古霉素50万单位关节腔内注射加强抗感染，硫酸庆大霉素16万单位湿敷。术后第30天，切口渗出好转，炎症指标好转，考虑炎症基本控制，停美罗培南针和利奈唑胺针，予利奈唑胺片0．6 g口服q12 h，联合利福平胶囊0．45 g qm继续抗感染治疗。术后第56天，患者局部切口少许渗出，分泌物提示近平滑念珠菌感染。复查CＲP指标持续好转，考虑定植菌可能。术后第59天，患者术后恢复可，局部切口仍少许渗出，告知出院后定期当地医院换药。定期门诊随访。

1．3病原学检查

1．3．1细菌培养2023年4月29日送检的关节液直接培养平板24 h后取出观察发现，哥伦比亚血琼脂平板(温州康泰公司)上生长细小灰白色菌落，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统(法国梅里埃公司)进行菌种鉴定，菌种鉴定结果为欧洲放线菌(置信度99．9%，预示鉴定结果极佳);另有灰白色、不透明、表面光滑、α－溶血、直径0．5～1 mm大小的圆形菌落，菌种鉴定结果为鸟肠球菌(置信度99．9%)。5月4日药敏结果显示欧洲放线菌对头孢西丁、利奈唑胺、替考拉宁、米诺环素、四环素敏感，鸟肠球菌对氯霉素、万古霉素、利奈唑胺、头孢曲松、头孢吡肟、替加环素敏感。

术中关节液5 m L分别注入血培养需氧及厌氧瓶(法国梅里埃公司)各两瓶，置于Bact/ALEＲT3D血培养仪(法国梅里埃公司)中培养，3 h 44 min后血培养仪需氧及厌氧瓶各有一瓶报阳，涂片染色均见有革兰阴性杆菌及阳性球菌(图2)，革兰阴性杆菌形态不典型。抽取报阳的血培养液体转种于血平板、巧克力平板、沙保弱平板(需氧及厌氧环境各一块平板)进行培养，24 h后取出观察，血平板生长灰白色、不透明、表面光滑、α－溶血、直径0．5～1 mm大小的圆形菌落(图3)。采用质谱仪进行菌种鉴定，血平板上菌落为鸟肠球菌(置信度99．9%)。5月8日药敏结果显示该菌对青霉素、万古霉素、氨苄西林、替考拉宁、氯霉素、利奈唑胺敏感。转种后的平板未见革兰阴性杆菌，考虑“L”型细菌可能。随后抽取5 m L报阳的血培养液注入分离胶采血管中，3 500 r/min离心5 min。弃去上清液，沉淀用1 m L无菌生理盐水重悬并12 000 r/min离心2 min两次。离心后菌株沉淀中加入“L”型增菌液1 m L，充分震荡后，吸取200μL菌液接种至血平板。同时，将剩余菌液转入8 m L“L”型增菌液中，置于35℃普通培养箱温育24 h及48 h后分别接种至血平板，并加贴万古霉素纸片。直接转种血平板24 h及48 h后均未见细菌生长。增菌后转种的血平板在24 h及48 h后均可见中等大小、湿润、凸起、无迁徙生长的灰白色菌落(图4)。采用质谱仪进行菌种鉴定，鉴定为斯氏普罗威登斯菌(置信度99．9%)。5月8日药敏结果显示该菌对氨曲南、头孢吡肟敏感，对阿米卡星中介。

1．3．2 m NGS结果检出细菌包括:601 435条序列索氏卟啉单胞菌、1 199 720条序列脆弱拟杆菌、664 414条序列马赛克菲诺拉菌、579 291条序列口颊普雷沃菌、715条序列放线菌、990条序列鸟肠球菌(图5)。检出病毒包括:60条序列细环病毒和6条序列小细环病毒6型。未检出真菌及寄生虫、支原体、衣原体、立克次体及疑似耐药基因。

1．3．3血培养与m NGS结果不符的复核关节液的血培养厌氧增菌培养延长至1周，再次抽取液体转种至血平板进行培养，厌氧环境下培养48 h后取出观察，血平板生长灰色、不透明、表面光滑、直径1～3 mm大小的圆形菌落(图6)，采用质谱仪进行菌种鉴定，鉴定为脆弱拟杆菌(置信度99．9%)。综合微生物培养与宏基因检测结果，考虑病原菌为脆弱拟杆菌、欧洲放线菌和鸟肠球菌混合感染，并针对以上病原体进行抗感染治疗［4］ 。

2讨论

慢性骨髓炎是一种慢性骨组织感染性疾病，其好发部位主要为胫骨和股骨，临床上最常见的症状是局部疼痛、红肿和窦道形成。实验室检查发现白细胞计数正常，而ESＲ和CＲP升高［5］ 。但在临床实践中病原学结果为阴性的概率较大，为增加培养阳性率，取材感染的骨组织进行培养时应停用抗生素至少1～2周，并辅以合适的培养方式，必要时可延长培养时间至14 d。为防止活检骨组织被杂菌污染，体外穿刺活检时应避开患者的溃疡和窦道部位。在植入物相关的慢性骨髓炎病灶部位取标本时，应该至少在植入物周围5个部位取标本，才能保证取材的准确性［6］ 。

普罗威登斯菌为兼性厌氧革兰阴性球杆菌，常导致泌尿系统感染、肺部感染、心内膜炎、脑膜炎、伤口和血液感染等［7］ 。本文中斯氏普罗威登斯菌为细菌“L”型，只能在高渗培养基下存活和增殖，在条件合适的时候又能恢复为细菌型。本文中m NGS未检出该菌，临床未针对其进行抗感染治疗，患者症状改善，考虑采样污染所致。脆弱拟杆菌是最常见的机会性致病厌氧菌之一，可引起腹腔内和盆腔感染、血流感染、皮肤和软组织感染以及骨髓炎，脆弱拟杆菌对β－内酰胺类、四环素类、氟喹诺酮类和大环内酯类相对不敏感［8-9］ 。鸟肠球菌可引起菌血症、心内膜炎、泌尿系统感染、腹腔感染等。肠球菌具有天然耐药和获得性耐药特性，固有耐药表现为肠球菌对头孢菌素类、氨基糖苷类、克林霉素和复方新诺明天然耐药［10］ 。结合本例患者放射影像和实验室相关检测结果，分析其感染机制可能是通过创口进入关节组织，共同作用引起感染。该患者关节液还培养出欧洲放线菌(Actinomyces europaeus)，是一种兼性厌氧的短小革兰阳性棒杆菌。放线菌属抗生素的选择和最佳治疗持续时间尚不清楚。放线菌属通常对β－内酰胺类抗生素敏感。青霉素或头孢菌素被认为是治疗放线菌病的一线药物［11-12］ 。

m NGS可检测各种病原体，包括通过普通培养难以分离的苛养微生物。与传统检测方法相比，m NGS无需培养，病原覆盖度广、灵敏度高，易于发现新的病原体。针对重症感染以及症状不典型、机体间断性排菌、临床实验室诊断困难的慢性感染，m NGS技术有较高的临床应用价值，能够快速、精准地找到病原体［13-14］ 。本研究中微生物培养和m NGS均检出了脆弱拟杆菌、欧洲放线菌和鸟肠球菌，临床医师结合病史、临床表现及辅助检查，诊断该患者存在以上3种菌的混合感染。综上所述，m NGS与常规培养方法的互补能显著提高病原学诊断水平，从而实现感染性疾病的精准诊断和治疗。

参考文献略。

来源：临床检验杂志2024年7月第42卷第7期