作者：孙一帆，洪丽华，吉林大学口腔医院牙体牙髓科

牙周炎由牙菌斑引起，是累及牙龈、牙周膜、牙槽骨的炎症性、破坏性疾病。在牙周长期、持续的炎症刺激下，牙槽骨可发生病理性吸收，最终导致牙齿脱落。牙周炎被认为是导致成人失牙的主要原因。根据第四次全国口腔健康流行病学调查报告显示，我国65～74岁年龄组中牙列完整者为18.3%，牙周健康率仅为9.3%。

牙周炎加重导致的口腔功能丧失，严重影响患者的咀嚼和消化功能。此外，牙周炎还与包括心、脑、血管疾病、糖尿病、呼吸道感染、类风湿关节炎等在内的多种全身性疾病有着密切联系，极大影响着人的全身健康和生活质量。

现阶段，牙周炎治疗聚焦炎症控制，虽可以延缓疾病进展，却难以获得满意的牙周组织再生。再生医学，特别是基于干细胞的疗法，在组织再生领域中受到很多关注。牙源性干细胞起源于胚胎神经嵴细胞，是来源于牙齿组织的间充质干细胞。

目前，成功分离鉴定的人牙源性间充质干细胞包括以下6种：牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)、牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)、牙龈间充质干细胞(gingival mesenchymal stem cells，GMSCs)、根尖乳头干细胞(stem cells from apical papilla，SCAPs)、脱落乳牙干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs)、牙囊干细胞(dental follicle stem cells，DFSCs)。

目前用于牙周再生研究的非牙源性干细胞外泌体来源主要是两种：骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)和脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)。牙源性干细胞除了来源丰富，容易获得外，其组织来源的特异性也是其优势所在。其外泌体可能含有牙源性特有的促牙周再生的物质。

相比之下，BMSCs在骨髓中含量极低，仅占骨髓有核细胞总数的0.001%～0.1%，而且BMSCs和ADSCs的获取具有一定的风险和创伤性，可能会引起感染等并发症。此外，与可以调节细胞蛋白水平或功能的材料相比，外泌体具有天然的磷脂双分子层，能将内含的蛋白质等分子运送到细胞中，是一种更有效的细胞间通讯选择。鉴于以上原因，牙源性干细胞来源的外泌体正成为牙周再生医学的理想候选者。

干细胞的特性及其在组织再生中的作用主要与其分泌和旁分泌作用有关。外泌体是一种纳米级的细胞外囊泡，包含mRNA、微小RNA(micro RNA，miRNA)及多种蛋白质。它们通过将内容物转移到受体细胞参与细胞间通讯，调节细胞活动。此外，外泌体的应用也可以解决活细胞直接应用带来的潜在风险，如免疫相容性、遗传多样性和感染传播等。

目前外泌体相关研究多集中在细胞水平和蛋白组表达水平，涉及成骨分化和炎症调节的相关信号通路，已证实DPSCs、SHEDs、PDLSCs、GMSCs来源的外泌体参与成骨分化和炎症相关机制的调控，此外，SHEDs和PDLSCs来源的外泌体参与血管化和血管再生。

虽然牙源性干细胞来源的外泌体间的差异尚未明确，但外泌体作为细胞信号传递的工具，其生物学功能和成分差异很大程度上是由其来源细胞决定的。在牙周再生中，相比于实现牙槽骨和牙龈的再生，牙根表面新生有序致密的牙周韧带和牙骨质更具挑战性。PDLSCs能够在适当的条件下分化为成骨细胞和成牙骨质细胞，在调节牙周组织稳态及牙周再生过程中至关重要，因此认为来源于PDLSCs的外泌体(PDLSC-Exos)是牙周组织再生最具优势的一类。

牙源性干细胞通过旁分泌作用释放外泌体，激活相关信号通路影响微环境中相关细胞的生物学活性，从而诱导牙周组织再生。基于以上，本文将对牙源性干细胞来源的外泌体在牙周组织再生中的研究进展作综述。

1. PDLSCs来源的外泌体与牙周组织再生

1.1 参与骨与血管再生

骨再生是一个非常复杂的过程，是建立在各种细胞类型之间相互作用的基础上。有学者对PDLSCs是否通过外泌体介导的细胞间信息传递参与成骨细胞的分化进行研究，发现PDLSC-Exos可以提高成骨细胞的增殖、迁移和抗凋亡能力，这些功能可能是通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylin-ositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)和丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular regulated protein kinases，MEK/ERK)通路实现的。

Liu等研究证实成骨诱导环境会增强PDLSC-Exos促BMSCs成骨分化的能力。RNA测序分析未分化和成骨分化期产生的PDLSC-Exo的miRNA表达谱，差异表达的miRNAs的靶基因富集于多条成骨相关通路，如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号、腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)信号和胰岛素信号通路等，揭示了成骨分化PDLSC-Exos的miRNA对BMSCs的成骨分化的可能作用。

此外，Yu等利用高通量测序发现补骨脂素处理后的PDLSC-Exos中has-miR-125b-5p水平降低，推测补骨脂素可能是通过下调has-miR-125b-5p的表达，作用于外泌体向PDLSCs传递成骨相关物质，促进PDLSCs的成骨分化。

成骨和血管生成是两个紧密联系的过程。聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是一种存在于其结构中可质子化氨基的聚合物，常作为递送DNA和RNA的载体。Pizzicannella等以聚乙烯亚胺作为细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)的载体(PEI-EVs)，并负载到胶原蛋白膜(3D-COL)支架中，评估其对颅骨骨缺损修复效果。

研究证明了3D-COL/PEI-EVs能使血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管内皮生长因子受体2的水平增加。外泌体是连接PDLSCs和血管内皮细胞之间的重要桥梁。牙周炎炎症微环境抑制PDLSC-Exos的miR-17-5p表达，从而促进其靶基因血管内皮生成因子VEGFA的表达，促进了牙周血管再生。牙周组织中血管生成障碍不仅影响成骨修复，而且是牙周炎导致进展性炎症的原因之一。

Zhao等将PDLSC-Exos负载在海藻酸盐-明胶水凝胶中， 并证明了通过水凝胶相互连接的网络逐渐降解，外泌体得以长期扩散的方式释放，能显著促进骨缺损区新骨沉积和牙槽骨缺损修复。

研究认为，外泌体促进骨再生的机制主要与成骨各阶段携带的miRNA发挥的调控作用有关。外泌体可以通过将miRNAs递送到受体细胞来调节表观遗传过程，调节受体细胞的生物学功能。因此，解码外泌体内部的信息将是探索细胞成骨分化的一种方式。Xie等发现在PDLSCs来源的外泌体(PDLSC-Exos)成骨分化过程中，其环状RNA(circRNA)和长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)表达谱发生了显著变化。但这些RNAs如何在PDLSCs成骨分化中发挥作用有待进一步研究。

1.2 抑制炎症反应

牙周炎患者常伴有辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)/调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)的功能紊乱，与宿主炎症和免疫反应的相互作用密切相关。炎症微环境会下调PDLSCs及PDLSC-Exos中miR-205-5p的表达。

Zheng等利用牙龈卟啉单胞菌脂多糖模拟慢性牙周炎炎症微环境，产生的PDLSC-Exos被CD4+T细胞摄取后，低表达的miR-155-5p可通过调控CD4+T细胞中沉默调节蛋白1(recombinant sirtuin 1，SIRT1)的表达来调节Th17/Treg平衡，通过Th17/Treg/miR-155-5p/SIRT1调控轴减轻牙周炎症。

此外，有研究发现Exo-miR-205-5p能够减少肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等炎症因子的产生，抑制炎症细胞浸润，降低Th17细胞的比例。X盒结合蛋白(X-box binding protein 1，XBP1)基因是miR-205-5p的靶基因，已被证实在受牙周炎影响的牙周组织中上调。Exo-miR-205-5p通过靶向XBP1抑制牙周炎症并调节Th17/Treg细胞平衡。

巨噬细胞在包括牙周炎在内的炎症过程中发挥关键作用。炎症微环境中的PDLSC-Exos富含miR-143-3p，通过抑制PI3K/AKT信号通路和激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信号通路，靶向抑制巨噬细胞中的PI3Kγ的表达，从而促进M1型巨噬细胞极化。提示PDLSC-Exos可能是牙周组织炎症的潜在治疗靶点。

健康牙周膜来源的PDLSC-Exos具有抗炎和促成骨作用。抗炎方面，它能够竞争性地与Toll 样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)信号通路的靶点结合，抑制PDLSCs中 NF-κB 的活性，此外，PDLSC-Exos能促进Akt及其下游靶点GSK3β(Ser 9)的磷酸化，通过PI3K/Akt信号通路抑制NF-κB活性，从而控制牙周炎的慢性炎症。在促成骨方面，Lei等将Matrigel水凝胶/β-TCP负载的PDLSC-Exos用于牙周炎大鼠牙槽骨缺损的修复，证明了PDLSC-Exos能够增强内源性干细胞的成骨能力，其机制可能与PDLSC-Exos抑制Wnt信号的过度激活有关。

1.3 调节细胞活性

衰老PDLSCs的增殖和分化能力下降，会影响牙周组织修复和再生的效率。Liu等利用高水平的葡萄糖加速PDLSCs的衰老，而PDLSC-Exos的miR-141-3p能够通过激活KEAP1-NRF2信号通路发挥抗细胞衰老作用。

2. GMSCs来源的外泌体与牙周组织再生

2.1 抑制炎症反应

M1型和M2型巨噬细胞的极化趋势在牙周炎的病理过程中发挥关键作用，调控巨噬细胞的极化可作为一种有效的疾病干预形式。多项研究证明，GMSCs来源的外泌体(GMSC-Exos)可使促炎型巨噬细胞向抗炎表型极化，降低TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的表达水平。

在PDLSCs中，NF-κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)的表达受Wnt5a的调控。TNF-α刺激下显著上调的miR-1260b被发现能特异性靶向Wnt5a下调RANKL的表达并抑制破骨活性。此外，使用TNF-α预处理GMSCs不仅增加了GMSC-Exos量，而且增强了外泌体CD73的表达，从而诱导了抗炎的M2型巨噬细胞极化。

2.2 参与骨再生

Wnt/β-catenin通路活化是GMSC-Exos促进PDLSCs增殖和成骨分化的关键调节因子。在牙周炎症环境中，NF-κB和Wnt/β-catenin信号通路之间可能存在相互排斥的调控作用。Hu等研究进一步表明GMSC-Exos介导NF-κB与Wnt/β-catenin信号通路在牙周炎症中的相互作用促进PDLSCs的成骨分化能力。GMSC-Exos也表现出抗破骨细胞生成活性。在大鼠牙周炎模型局部注射GMSC-Exos显著降低了牙周骨丧失和抗酒石酸酸性磷酸酶阳性破骨细胞的数量，而TNF-α的预处理进一步增强了这些作用。

3. DPSCs来源的外泌体与牙周组织再生

学者分别从牙周炎患牙、牙周健康牙中提取DPSCs，并证明了两种DPSCs来源的外泌体(DPSC-Exos)均具有促血管生成作用。但相较于健康牙来源的DPSC-Exos，牙周炎患牙DPSC-Exos能使血管内皮获得更高的血管生成相关基因的表达水平，在刺激血管内皮细胞增殖、迁移和成骨方面具有更强的潜力。

新骨的再生需要激活相关成体干细胞的成骨向分化。DPSC-Exos通过高表达的环状溶血磷脂酸受体1(circular lysophosphatidic acid receptor 1，circLPAR1)与hsa-miR-31结合，消除has-miR-31对成骨的抑制作用并上调特异AT序列结合蛋白2(special AT-rich sequence-binding protein 2，SATB2)表达，从而促进DPSCs成骨分化。

Shen等将壳聚糖水凝胶作为负载DPSC-Exos的支架并应用于牙周炎大鼠模型牙槽骨缺损处，证明了DPSC-Exos能够通过下调牙周组织中NF-κB和p38 MAPK信号通路的激活，加速骨和牙周上皮的愈合。此外，DPSC-Exos还能够促进巨噬细胞向抗炎表型转化，其机制可能与外泌体中的miR-1246有关。

4. SHEDs来源的外泌体与牙周组织再生

4.1 参与骨与血管再生

SHEDs来源的外泌体(SHED-Exos)能够抑制BMSCs成脂相关蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)的表达，并通过参与Smad5(recombinant SMAD family member 5)/Runx2 (Runt-related transcription factor 2)信号通路，上调成骨相关转录因子Runx2和p-Smad5的表达，从而促进BMSCs成骨分化。

另有学者研究结果表明，经SHED-Exos处理后，血管生成相关基因(KDR、SDF-1和FGF2)、成骨相关基因(COL1、RUNX2、OPN)和磷酸化的AMPK的表达上调。SHED-Exos可能是通过AMPK信号通路增强血管生成与牙槽骨再生。

4.2 调控PDLSCs成骨向分化

PDLSCs被认为是牙周组织再生的重要参与者。成骨诱导条件下，SHED-Exos会上调PDLSC中成骨相关基因Runx2、OPN、OCN的表达。Wnt和BMP信号通路对成骨分化至关重要。SHED-Exos通过其内容物Wnt3a和骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP2)，增强了PDLSCs中Smad1/5/8磷酸化和核内β-catenin蛋白表达，从而激活Wnt/β-catenin和BMP/Smad信号，调控PDLSCs的成骨分化。

此外，研究表明，SHED-Exos能极大地促进PDLSCs的迁移、凋亡和增殖，促进细胞周期从G1期向S期转换，并通过增强Runx2的表达促进PDLSCs成骨分化。基于生物信息学分析，其机制可能为SHED-Exos被PDLSCs摄取后，通过其内的miRNA调控靶基因MAPK9、PARP6和Smad7，进而调控相应的MAPK和Wnt信号发挥作用。

5. 展望

牙周炎是成人失牙的主要原因。实现牙周组织再生，保存更多的天然牙对维持口腔健康十分重要。牙源性干细胞来源丰富、容易获得，由牙源性干细胞分泌的外泌体内含多种生物活性物质，经摄取调控受体细胞的生物学功能。此外，外泌体的应用不仅解决了活细胞直接应用带来的免疫排斥、医学伦理学等问题，或许可以达到与活细胞直接应用相当的治疗效果，有望成为无细胞疗法的热点。但目前对于牙源性干细胞对牙周再生方面的机制研究仍处于初期阶段，未来仍需要更多研究证明其性能。

直接注射、水凝胶、胶原海绵等递送系统是目前外泌体研究的主要给药方式。外泌体直接注射于牙周缺损区，唾液、龈沟液的流动和牙周袋暴露的环境会导致外泌体的快速释放，使其难以发挥持续的治疗效果。使用生物相容性和生物可降解的递送系统将外泌体递送到牙周袋中，可以达到控制释放、延长半衰期，从而保持其作用的目的。由于目前用于牙周再生治疗的实验有限，所用外泌体剂量从几十微克到几百微克不等，但作为一种有前途的治疗方式，确定药物剂量、阐明药代动力学和开发高效给药模式对确保其安全性、有效性及提高未来临床应用治疗潜力至关重要。

随着多种牙源性干细胞来源的外泌体用于牙周再生的研究越来越深入，不同来源的外泌体是否有疗效差异、如何保持外泌体的生物活性、如何实现外泌体在环境中的缓释等问题都将是未来研究所需关注的重点。

来源：孙一帆,洪丽华.牙源性干细胞来源的外泌体在牙周组织再生中的研究进展[J].口腔医学研究,2024,40(04):287-292.