作者：包头医学院第一附属医院／ 包头医学院（陈奇，王羽，张春阳，张磊，杜秉承，赵志军）；济南市莱芜区高庄街道社区卫生服务中心（谷体英）；深圳市龙岗区第三人民医院（邵国）

颅骨作为脑组织最直接的保护屏障，若出现缺损不及时修补会因体位、情绪和负压等导致脑组织在颅内移动，从而造成脑穿通性畸形、癫痫发作和脑变性萎缩等伤害，因此尽早修补颅骨缺损可以减少脑组织的损害。

研究表明，临床一直沿用的治疗颅骨缺损的方式包括自身颅骨回填、自体骨和异体骨移植、钛网等材料修补。自身颅骨的回填方式需要将手术取下的颅骨置于腹部，给患者造成极大的生活障碍，自体骨的移植对于较大的缺损却无法实施，异体骨以及钛网的植入可能会引起免疫排斥反应导致修补的失败。

干细胞的骨再生和骨组织工程技术是颅骨修复和重建领域的一种尖端技术。神经嵴细胞(neural crest cells，NCCs)是脊椎动物早期发育过程中从神经管背缘发育而来的一组独特的细胞，作为一种去分化状态的干细胞大量存在于脐带血和成体动物组织当中，广泛迁移到大多数组织和器官中，并产生多种分化的细胞类型；它们为干细胞的骨再生和骨组织工程提供了一个具有治疗前景的储备库，因此NCCs 在颅骨修复领域中成为越来越热门的研究对象。

1. NCCs 的特点及表面标志

1. 1 NCCs 的特点

神经嵴(NC)是脊椎动物胚胎中的独特结构，脊椎动物体内几乎没有一个器官或组织是NCCs 不贡献的。NCCs 具有很强的增殖能力和多向分化的潜能，有助于全身多种细胞类型和组织的构成，如神经、骨骼、肾上腺和甲状腺的内分泌细胞及结缔组织等。NCCs 具有与巨噬细胞相似的吞噬作用，可在白细胞介素-1β 介导下，吞噬细胞碎片形成PI(3)P + 和Lamp1 + 的吞噬体。NCCs 还可以分泌细胞因子、趋化因子、营养活性因子等。因此，由于这种多能性，它被称为第四胚层。

1. 2 NCCs 的表面标志

NCCs 与其他干细胞一样，表面标志物存在多种。经过对NCCs 的生物标志物广泛的研究，排除了因传代原因表面标志的降低以及相对高水平的血管内皮细胞标志物CD31，造血干/ 祖细胞标志物CD34、CD133 和间充质干细胞标志物CD13、CD73，确定了几个关键的标志物，分别为p75/ CD271、HNK1/ CD57、a4/ CD49d，其中p75 神经营养因子受体(p75NTR)也称为低亲和力神经生长因子和CD271，被公认为NCC 的稳健标志物。

2. NCCs 成骨分化的影响因素

目前已经证明，有多种多样的相互作用信号、转录因子和下游效应器决定NCCs 的命运、迁移和分化。NCCs 在一定的影响因素下，可转换成为成骨细胞，为治疗骨相关的疾病提供前提，尤其是在颅骨的缺损修复方面。诱导NCCs 成骨的相关通路很多，其中转化生长因子β(transforming growth factor β， TGFβ)、成纤维细胞生长因子( fibroblast growth factor， FGF)、Wnt、骨形态发生蛋白( bone morphogenetic protein，BMP)、河马信号( Hippo-Yap)、血小板生长因子(platelet growth factor，PGDF)、刺猬信号(Hedgehog，Hh)被认为是调节NCCs 成骨分化的重要信号通路。

2. 1 TGFβ

TGF 信号传导调节组织间相互作用，以控制器官发生和组织稳态，其在NCCs 来源的骨的增殖和分化中起着至关重要的作用。TGFβ 是通过TGFβ Ⅱ 型受体和TGFβⅠ型受体(又名Alk5)形成的异构体复合物诱导细胞内Smad(Smad2/3)，以调节颅骨发育过程。NCCs 中Tgfbr2的缺失会导致非典型TGFβ 信号被激活，而典型TGFβ 信号传导受到损害，造成颅骨畸形，TGFβ 激活激酶1(TGFβactivate kinase 1，Tak1)的缺失，导致Tak1 缺陷突变体显示圆形颅骨，上颌骨、下颌骨发育不良以及不同程度的腭裂发生。

2. 2 FGF

FGF 主要通过FGF 受体1 (FGF receptor 1，Fgfr1)与Fgfr2 调节NCCs。抑制转录因子Bcl11b 和同源蛋白基因1(EN1)是Fgfr2 的调节因子。Bcl11b 主要在颅缝间充质中表达。在NCCs 中，敲除Bcl11b 会使颅骨矿化增强以及成骨细胞过早分化。

2. 3 WNT 和BMP

目前发现两种WNT 的抑制剂，Tcf7l1(Wnt 靶基因的转录抑制因子)和Dkk1。Tcf7l1 的条件失活导致前神经外胚层中Wnt/ β-连环蛋白信号传导的异常激活及NCCs 的转化，而Dkk1 通过抑制Wnt/ β-连环蛋白信号传导可造成胚胎的前部区域缺乏NCCs。Bmp4-Msx1 通路和Osr2 可通过对抑制Wnt 拮抗剂的分泌，使Dkk2 和Sfrp2 得以表达，避免颅骨发育异常。

另外在体外单纯使用Bmp4处理NCCs 后，NCCs 骨相关基因的水平增加，其能够产生更多骨细胞。

2. 4 Hippo-Yap

Hippo-Yap 通路是一种保守的基础通路，在调节细胞增殖、存活和分化方面起关键作用，对于正常的NCCs 发育是必不可少的。Hippo-Yap 通路可调节胚胎中BAF 到NC 的迁移中发挥作用。Hippo 激酶Lats1/2 通过抑制下游复合物的形成促进NCCs 的增殖和存活。FoxO6是Hippo-Yap 传导的激活剂，在小鼠发育的后期，FoxO6 在颅骨组织中特异性表达，引导颅骨的扩张。

2. 5 PGDF

PGDF 包括四个配体(PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D) 和两个酪氨酸激酶受体( PDGFRα 和β)。PDGFRα 和β 调节胚胎发生期间的颅骨发育，两种信号传导共同降低时，颅面部间充质的增殖显著降低。Mo 等的研究发现，PDGFRα 在NCCs 迁移中起主要作用，而PDGFRβ主要有助于妊娠中期颅面部间充质的增殖。

PDGFRα 可以激活三种主要的信号传导途径，磷脂酶C-γ(phospholipase C-γ，PLC-γ)途径最为重要。PDGFRα 信号通过激活PLC-γ 途径刺激NCCs 引起骨细胞的增殖加强， 成骨细胞矿化加速。

2.6 Hh 信号

在过去的二十年中，已经确定了Hh 信号在颅骨形成中的关键功能。Hh 信号通路的组成包括多种配体，其中刺猬配体(声波刺猬[SHh]、印度刺猬[IHh] 和沙漠刺猬[DHh])在颅面形态发生中发挥重要作用，Shh 向NCCs 发出信号，避免异常的NCCs 发育和畸形的颅底。Shh 上调NCCs 中的Osx 表达，增加NCCs 衍生细胞的产生，并间接上调破骨细胞活性，导致更多的骨吸收和更少的骨强度。

3. NCCs 在颅骨缺损修复中的作用

颅骨缺损后自身骨或刚性材料均有局限性，而应用干细胞搭载支架来修补颅骨缺损修复有广阔前景，NCCs 的高成骨、低成脂、同源兼容、细胞吞噬、组织及神经修复性的作用突出，可能成为理想选择。

3. 1 NCCs 的提取及分离

3.1. 1 NCCs 的提取方法

NCCs 从神经管中分离并迁移到颧弓，在颧弓处显示出骨骼和软骨独有的特征，因此有一种方法是通过手术直接从胚胎中获取颧弓，使用该方法进行实验，需要经过通过动物保护机构和使用委员会批准。而另一种方法是通过诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，从中提取NCCs。iPSCs 可从胎儿的脐带血中获得，通过诱导iPSCs 使其转变为NCCs，不但不会引起医学伦理，而且取之不尽、用之不竭。

3. 1. 2 NCCs 的分离

通过颧弓来获取NCCs，需要用细胞解离酶(TrypLE) 对其进行处理，在100 × g 转速下离心5 min，去掉上清液后，加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)，继续用相同的转速和时间反复处理3 ~4 次，最后获得CNCs。另外，通过诱导iPSCs 转变为NCCs，可直接获得NCCs。两种方式都需要通过迭代培养，获取贴壁生长的NCCs。

3. 2 高成骨和低脂肪化作用

目前采用的干细胞大多选用脂肪干细胞和骨髓干细胞，而现在研究的NCCs 在颅骨的修复中表现出了高于其他干细胞的高成骨和低脂肪化能力。Xu 等的研究进一步证实，虽然脂肪干细胞和骨髓干细胞具有相似的形态和细胞表面标志物，但他们的分化潜能受到其来源组织的高度影响，并通过重要转录因子的DNA 甲基化等表观遗传调控；因此，与脂肪干细胞相比，骨髓干细胞具有更强的成骨能力，脂肪分化潜力较低。

Srinivasan等的研究发现，无论是在二维培养中还是在PCL-Tcp 支架中，NCCs 在早期成骨细胞阶段维持增殖时间更长，并在传代后仍保持高增殖能力；NCCs 还能分泌促进宿主成骨细胞增殖和分化的因子，这些因素导致NCCs 相对于骨髓干细胞具有更好的增殖能力，并显示出良好的成骨和成软骨分化能力，但成脂分化较低。NCCs 在颅骨缺损处形成骨化中心以及表现为低凋亡率和高成骨能力，使修补能达到更好效果。

3. 3 同源兼容作用

颅骨架的主要部分及其干细胞起源于NCCs，包括额叶和顶间部分以及矢状颅缝。Glaeser等采用骨髓干细胞和NCCs 同时对颅骨缺损处进行修补实验，发现随着植入时间的增长，NCCs 比骨髓干细胞的存活率高，存活时间长。置入的NCCs 与缺损边缘之间相比于骨髓干细胞，呈现出高连接密度(骨桥接连接紧密)和少量的纤维化。NCCs 修补颅骨缺损后表现出较高的生物力学性，不但修补处的骨厚度增加，而且缺损处骨与周围颅骨连接紧密，从而能抵抗更强的外力对脑组织带来的伤害。

3.4 适用于外伤导致的颅骨缺损修复

外伤导致的颅骨缺损常常伴随着无菌性炎症，面部皮肤受损，脑挫伤等情况。NCCs 具有吞噬作用，在损伤发生后，吞噬功能的水平显著增加，在吞噬损伤和死亡的细胞后，形成PI(3)P和Lamp1 吞噬体。这种吞噬性能够有效地减少无菌性炎症的发生，从而大大增加缺损修复的成功率。NCCs 在颅面部参与组织再生，两栖动物肢体再生的研究也证明了这一点。

NCCs 与其他种类干细胞最大的不同在于，当周围神经受到损伤时，可以迁移到损伤处，与损伤处的组织相互融合建立联系，通过激活施万细胞释放多种因子修复周围受损的神经。NCC 自身也会产生和分泌多种神经营养因子，来促进受损的神经突生长和周围神经再生。

4. 总 结

综上所述，在目前研究的干细胞中，NCCs 显得尤为突出。NCC 参与几乎所有脊椎动物器官和组织形成。相比于目前修复所用的干细胞，NCCs 所具有的吞噬功能可以降低周围坏死物质引起的炎症反应。NCCs 的低死亡率和高成活率，为缺损处所需的细胞数量提供保证，NCCs 的自我更新能力优越，增加修复区域的成功率。此外，NCCs 还能激活神经胶质细胞，分泌和释放营养和修复因子，修复周围受损的神经。

相比于间充质干细胞，采用NCCs 进行修复与颅骨缺损的边缘结合更加紧密，抵抗外力对颅脑的损伤的作用更强。这使修复的区域与自身成为一个整体，这是其他干细胞所不能办到的。随着脐带血的存贮和利用率的不断提高，获取NCCs 变得更加便捷、高效。目前，利用NCCs 进行修补虽然只停留在动物实验阶段，但缺损修复取得了重大的成果。随着科研人员对NCCs 不断深入研究，脊椎动物实验的不断改进和完善，NCCs 将会为未来临床颅骨缺损修复带来新的高效治疗途径。

来源：陈奇，谷体英，王羽，等.神经嵴细胞在颅骨缺损修复中的研究进展[J].临床神经外科杂志，2025，22(01):106-108+113.